ReP USP - Detalhe do registro: Estudos bioquímicos e moleculares de lipase de Fusarium verticillioides e aplicações biotecnológicas
Estudos bioquímicos e moleculares de lipase de Fusarium verticillioides e aplicações biotecnológicas (2014)
Autor USP: FACCHINI, FERNANDA DELL ANTONIO - FMRP
Subjects: LIPASE; FUSARIUM; FERMENTAÇÃO; BIOTECNOLOGIA
Abstract: As lipases (EC 3.1.1.3) são um grupo de enzimas que atuam na interface orgânico-aquosa, catalisando a hidrolise de ligações éster-carboxílicas e liberando ácidos e álcoois orgânicos. Este trabalho teve como objetivo a prospecção de fungos produtores de lipases com capacidade de transesterificação, o estudo da produção de lipases em fermentação submersa (FSm) bem como a purificação, imobilização, caracterização e aplicação deste enzima, seguido de expressão heteróloga da lipase de Fusariuzn verticillioides em Pichia pastoris. Foram coletadas amostras em diferentes locais e ao todo foram isolados 33 fungos. Dos fungos analisados F. verticillioides e Aspergillus phoenicis apresentaram maiores produções lipolíticas e capacidade de transesterificação. Estudos de delineamento experimental indicaram influência positiva de peptona, K'H IND. 2''PO IND. 4' e Mg'SO IND. 4' sendo que o melhor meio de cultivo para a produção de lipases por F. verticillioides foi o meio Adams modificado (0,15% de KH2PO4, 0,025% de MgSO4 e 0,3% de peptona), adicionado de óleo de girassol 1% (v/v), sob agitação (100 rpm), por 96 horas. Para o A. phoenicis a interação entre peptona e glicose influenciou positivamente a produção e o meio de cultivo foi padronizado com peptona 0,35%, glicose 0,01% e sais SR, adicionado de 1% (v/v) de óleo de polpa de macaúba. Na caracterização dos extratos brutos, as lipases de F. verticillioides e A.phoenicis apresentaram temperatura e pH ótimos de 45° e 55°C; 5,0 -7,5 e 4,5 respectivamente. A estabilidade térmica de ambos os fungos foi melhor a 30 e 40°C, sendo que apenas o A. phoenicis foi estável a 50°C. Quanto a estabilidade ao pH ambos foram mais de 50% estável em pHs na faixa de 4,0-7,0. A estabilidade em surfactantes indicou que o Triton X-100 e o Tween 80 influenciaram positivamente na atividade dos extratos brutos, contrariamente à presençados solventes orgânicos. O F. verticillioides apresentou maior produção comparado ao A. phoenicis e foi utilizado para os próximos passas. Dessa forma, o filtrado da FSm foi purificado em cascata utilizando resinas com diferentes hidrofobicidades, isolando-se duas lipases: uma após adsorção em octil Sepharose de 30,3 kDa (LFV1) e outra após adsorção em decaoctil (C18) de 68,0 kDa (LFV2), com recuperação de 44,5% e 25,7%, e fator de purificação de 2,14 e 4,11, respectivamente. Essas enzimas possuem pH e temperatura ótimos de 5,0 e 6,0, respectivamente e 40°C para ambas. Foram termoestáveis a 40°C e ambas mantiveram mais de 50% de sua atividade na faixa de pH entre 5,0 e 7,0 após 180 minutos. Ainda, foram parcialmente ativadas por 'Ca POT. +2' e 'Ba POT. +2'. KM e Vmáx ficaram em torno de 0,16 µM e 47,71 mM/min.mg para a LFV1 e de 0,26 µmol e 37,4 mM/min.mg para a LFV2 segundo obtido pelo software SigrafW. Ambas as LFVs foram imobilizadas em glioxil, PEI Manae, DEAE, BrCN-Sepharose e a estabilidade térmica e ao pH aumentou consideravelmente após este processo e, consequentemente foram aplicadas em processos biotecnológicos. A hidrólise do óleo de sardinha catalisado pelas lipases de F. verticillioides imobilizadas em diferentes derivados indicou maior razão EPA/DHA de 33,3 MANAE-LFVI. No processo de etanólise do óleo de sardinha a LFV2 apresentou maior conversão (5,5%) comparada à outra lipase e também apresentou melhor capacidade de transesterificação de acordo com os resultados obtidos na síntese de biodiesel, embora com baixa conversão. A LFV1 foi capaz de hidrolisar óleos vegetais para produção de ácidos graxos livres e preferem cadeias carbônicas mais longas, independentes das insaturação. Ainda, as lipases hidrolisaram partículas de gordura com efluente de frigorifico. Ambas LFVs apresentaram atuação na liberação de enantiômeros R na hidrolise de butiratomandélico e HPBE. Dessa forma, devido a excelente catálise apresentada pela LFV1 e as suas propriedades, a mesma teve sua sequência de aminoácidos analisada por MS e, dessa forma que foi possível expressar essa lipase em Pichia pastoris. A lipase LFVipl foi segregada com êxito na bactéria recombinante com uma massa molecular aparente de 36 kDa Ainda, a mesma foi purificada com sucesso em coluna com resina de níquel com recuperação de 91,7% e fator de purificação de 3,37, respectivamente. Esta enzima apresentou temperatura e pH ótimos de 4,5 e 85 °C, com 20% da atividade na termoestabilidade a 90 °C em 24 horas. Os íons de 'Ca IND. +2' e 'Ba IND. +2' aumentaram a atividade da lipase recombinante. Portanto, a produção, purificação, imobilização, aplicação e o sistema de expressão à base de P. pastoris para a lipase de F. verticilliodes neste estudo foram promissores
FACCHINI, Fernanda Dell Antonio; POLIZELI, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes. Estudos bioquímicos e moleculares de lipase de Fusarium verticillioides e aplicações biotecnológicas. 2014.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.
Facchini, F. D. A., & Polizeli, M. de L. T. de M. (2014). Estudos bioquímicos e moleculares de lipase de Fusarium verticillioides e aplicações biotecnológicas. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
Facchini FDA, Polizeli M de LT de M. Estudos bioquímicos e moleculares de lipase de Fusarium verticillioides e aplicações biotecnológicas. 2014 ;
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