PRIMERS E SONDAS
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O desenho de primers é o passo chave para uma reação de PCR bem sucedida. A capacidade de se verificar oligonucleotídeos sem interações não específicas é essencial para o desenvolvimento de testes para diagnóstico e a pesquisa científica. Quando se desenha primers para aplicações em PCR multiplex, seja ele convencional ou Real-time PCR, é essencial verificar o tamanho do amplicon, selecionar as seqüências senso e anti-senso livre de potenciais dímeros ou formação de alças intramoleculares, para que a reação seja totalmente eficiente. Este processo requer a utilização de ferramentas de bioinformática e experiência na confecção de primers.
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ESCALA SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DISPONÍVEIS: 50nmol, 200nmol e 1 µmol
Nota: Relação da escala de síntese x rendimento final:
A escala de síntese e rendimento final não são os mesmos devido aos vários passos envolvidos na síntese da sonda e do oligonucleotídeo. Estas etapas incluem o acoplamento de cada base, clivagem do oligonucleotídeo de suporte sólido e os passos de purificação. A combinação destes passos faz com que o rendimento final do oligonucleotídeo ou da sonda ser menor do que a escala de síntese (material de partida).
ESCALA DE SÍNTESE
SÍNTESE DE OLIGO PADRÃO, LIVRE DE SAL (POR BASE)
20-40 nmol.
80-160 nmol.
400-800 nmol.
PURIFICAÇÕES DISPONÍVEIS: -Sem purificação (Salt-free):
Oligos não purificados, dessalinizada (também conhecido como "salt free") são adequados para aplicações tais como microarrays, sequenciamento ou primers para PCR em Tempo-Real. - Reverse Phase Cartridge Purification (RPC) - Purificação por cartucho de fase reversa:
Recomendado para oligonucleotídeos (primers) não marcados. Oferece aproximadamente 75% de pureza*. Contaminantes como sequências cortadas, sais de amônio e impurezas são removidos do produto final. Os oligos purificados por RPC são sintetizados com o grupo DMT ao final da seqüência, o que permite a separação por afinidade do grupo DMT à resina do cartucho. As seqüências cortadas, sem o grupamento DMT, não se ligarão a resina do cartucho e serão desprezadas. Em seguida, os oligos purificados serão eluídos do cartucho. Para oligos de 50 pares de bases ou menos, o RPC fornece um produto de comprimento completo. Para oligonucleotídeos marcados, como sondas fluorescentes, recomendamos o HPLC de fase reversa (RP) ou o HPLC duplo (AX/RP) HPLC.
- Reverse Phase HPLC Purification (RP-HPLC) - HPLC de fase reversa:
Adequado para eliminar contaminação fluorescente remanescente da síntese da sonda. Quando não removida, a fluorescência na linha de base aumenta e impede a detecção da clivagem da sonda. Oferece aproximadamente 85% de pureza*, além de alto rendimento. Esta técnica é similar a purificação por cartucho de fase reversa, porém estas resinas fornecem maior capacidade de amostra.
- Anion Exchange HPLC Purification (AX-HPLC) - HPLC de troca iônica:
Adequado para eliminar falha de sequências quencher resultantes do acoplamento de base durante a síntese. Estas impurezas competem com a sonda para encontrar o amplicom e atrasam o ciclo.
- Double HPLC Purification (RP/AX) - HPLC de troca iônica seguido por HPLC de fase reversa:
Método utilizado quando é necessário processo de purificação mais rigoroso, para aplicações como em reações multiplex. Resulta em produtos com 90% de pureza*.
* A pureza final é determinada pela seqüência, tipo e comprimento dos oligos, e modificações selecionadas. O grau de pureza pode variar dependendo da complexidade do oligo.