Transferência de girino anestesiados em câmara de eletroporação cheia de mídia eletroporação. Embrião posiçãodentro do prazo também para que a cabeça repousa no entroncamento com a face dorsal baixo e de lado ventral exposta. A cabeça deve ser ligeiramente elevada em comparação com a cauda.
Utilizando uma pinça, gentilmente segura girino bem com em torno de plasticina. (Nota:.. Se o girino não é garantido, pode se contorcer e contato do eletrodo durante a eletroporação Neste caso, descartar o girino como tecidos faciais será severamente danificado)
Utilizando uma pinça cuidadosamente liberação de girinos de bem e transfira para 04/03 NAM, 0.025 gentamicina mg / ml.
O uso de moléculas fluorescentes permite a triagem de embriões electroporated fácil. A Figura 4 mostra um lote típico de MO electroporated girinos ~ 12, 48 e 96 horas após a eletroporação, incubados a 14,5 ° C. Usando microscopia de fluorescência, MOs podem ser visualizados imediatamente após eletroporação e persistir por vários dias após a eletroporação. Em nossa experiência, a fluorescência é fracamente evidente na fase 46 (~ 5 dias depois). Nas cartilagens, fluorescência diminui drasticamente após o início da diferenciação (~ 42 º), no entanto, MO fluorescência persiste mais fortemente em outros tipos celulares, como a endoderme da faringe. Microscopia de fluorescência mostra que oligonucleotídeos são incorporados em vários tecidos craniofacial, incluindo cartilagem. Oligonucleotídeo fluorescência cmuitas vezes um ser visualizado no tecido de cada lado da cabeça. Este é provavelmente devido a rápida difusão da solução injectável em todo o mesênquima frouxo craniofacial antes de eletroporação.
Figura 1 Homemade eletrodos. L-shaped fio de tungstênio é anexado a uma seringa de 1 ml usando non-toxic da argila ou massa de vidraceiro. (A) O término do eletrodo mede 5 mm. (B) Anexar um par de eletrodos, de modo que os términos correm paralelas. Eletrodos são ligados ao gerador de pulsos por cabos DC.
Figura 2 câmara de eletroporação. (A) 90 milímetros prato forrado com plasticina é preenchido com a mídia e uma câmara em forma de T esculpida com uma pinça Não é relojoeiro 5. (B) O lado mais comprido mede 2 mm X 2 milímetros X10 milímetroenquanto as medidas de curto 2 milímetros X 2 mm X 5 mm. A cabeça do embrião repousa no entroncamento, parte ventral para cima.
Figura 3 Esquema ilustrando procedimento eletroporação. St. 28 de girinos é colocado na câmara de eletroporação, lado ventral para cima. Micropipeta é inserida em glândula de cimento facial mesênquima subjacente. Injetar. Micropipeta é removido e em forma de L eletrodos são alinhados em paralelo de acompanhamento da cabeça. Aplicar oito de 50 ms, 20 pulsos mV quadrados. Retrair eletrodos. Girinos crescem para estágios desejado. Visualize MOs ou GFP expressão usando microscopia de fluorescência.
Figura 4 girinos Representante 12 (A), 48 (B), e 96 (C) horas após eletroporação (etapas 30, 34 e 44 respectivamente). (A "-B") Fluorescente MO pode ser visualizado no mesênquima craniofacial em stages 30 e 34. Fluorescência pode ser detectada nas cartilagens na fase 44 (ponta de seta,'c C "). O intestino é altamente autofluorescent.