A ciência por trás das infecções e do diagnóstico de Mycoplasma hyopneumoniae – Agroceres PIC
A ciência por trás das infecções e do diagnóstico de Mycoplasma hyopneumoniae
Maria Pieters, DVM, PhD. Medicina Veterinária Populacional, Universidade de Minnesota. Leman Conference, 2011.
O Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) é o agente etiológico primária da Pneumonia Enzoótica (Mare and Switzer, 1965; Goodwin et al., 1965), uma enfermidade respiratória crônica que afeta suínos de todas as idades (Ross, 1999) e que tem distribuição praticamente mundial. O efeito prejudicial da infecção por M. hyopneumoniae está relacionado com a ação direta do patógeno no trato respiratório e, mais importante, por deixar os animais mais predispostos a outras infecções respiratórias virais ou bacterianas (Maes et al., 2008). Resumindo, a infecção por M. hyopneumoniae pode afetar gravemente o desempenho dos suínos causando perdas importantes para a suinocultura e prejudicando o bem-estar dos animais.
As infecções por M. hyopneumoniae têm alta prevalência, podem ser transmitidas através do contato direto entre os animais ou pelo ar, e uma vez que esse patógeno entra em uma granja passa a ser um problema duradouro. Várias estratégias podem ser usadas para controlar infecções por M. hyopneumoniae, e é possível a erradicação tanto de granjas suínas como até mesmo de países (Stark, 2007). Entretanto, o diagnóstico do M. hyopneumoniae em situações de campo continua sendo complicado tanto para veterinários quanto para laboratórios. Este documento resume vários pontos importantes na dinâmica da infecção por M. hyopneumoniae.
A dinâmica da infecção por M. hyopneumoniae e suas implicações sobre o diagnóstico
Quer naturais, quer induzidas experimentalmente, os marcos da infecção por M. hyopneumoniae são: (1) o intervalo de tempo até a manutenção dos sinais clínicos e, (2) o longo período de tempo em que a infecção permanece antes de o agente ser eliminado do sistema respiratório dos suínos.
O M. hyopneumoniae é um patógeno do trato respiratório dos suínos, diferentemente de outros membros do gênero Mycoplasma que podem ser encontrados nesses animais (por exemplo, M. flocculare) e que não causam doença (Thacker et al., 2006). O M. hyopneumoniae é uma bactéria pequena que não possui inúmeras vias metabólicas importantes, tornando-a um parasita obrigatório dos suínos. Os Mycoplasmas possuem requerimento de crescimento especiais e tem uma taxa de multiplicação bastante lenta. Um período de 7 horas para a duplicação parece ser a média para cepas de M. hyopneumoniae em condições ideais de cultura, e esse tempo pode ser mais longo dependendo da virulência do isolado (Meyns et al., 2007). No entanto, o isolamento da bactéria é considerado o "padrão-ouro" para o diagnóstico de M. hyopneumoniae. Essa prova não é feita na rotina principalmente devido à baixa sensibilidade da técnica, à necessidade de um meio especializado, ao tempo que leva para completar o processo e à alta taxa de contaminação com outras bactérias (como M. hyorhinis). Portanto, a cultura só é feita em alguns casos específicos e são poucos os laboratórios que realizam esse exame.
Isolados de M. hyopneumoniae foram classificados em três grupos de virulência com base em parâmetros clínicos e patológicos: isolados altamente virulentos, isolados moderadamente virulentos e isolados pouco virulentos (Vicca et al., 2003). Mais recentemente, técnicas de tipificação bacteriológica e molecular permitiram a confirmação dessas diferenças entre isolados (Meyns et al., 2007; Stakenborg et al., 2007; Vranckx et al., 2011).
Os suínos se infectam com M. hyopneumoniae pela via respiratória, através do contato direto com animais infectados (por exemplo, transmissão da matriz para sua leitegada; Casalmiglia and Pijoan, 2000), ou inalando o microorganismo do ar vindo de galpões contaminados (Fano et al., 2005; Otake et al., 2010). Uma vez infectado, um suíno pode funcionar como amplificador da infecção por um longo período, eliminando o agente por até 7 meses após a inoculação (Pieters et al., 2009). A transmissão entre os animais de uma baia tende a ocorrer lenta e efetivamente, como demonstrado através de um baixo, mas constante R0 de 1,16 (Meyns et al., 2004). Mesmo em grupos vacinados a transmissão ocorre sem diferença significativa quando comparada à de animais não vacinados sob condições experimentais (Meyns et al., 2006; Pieters et al., 2010) e de campo (Villareal et al., 2011).
O curso da infecção por M. hyopneumoniae é dividido em duas fases, aguda e crônica, dependendo da apresentação dos sinais clínicos (tosse seca). Considera-se que a fase aguda começa com a infecção seguida pelo aparecimento da tosse, e termina quando a tosse cessa. A fase crônica se refere ao período de tempo em que o animal continua infectado, mas sem apresentar tosse. A fase crônica da infecção por M. hyopneumoniae é extraordinariamente longa e o microoganismo persiste no trato respiratório do suíno na presença de uma resposta imunológica detectável (como anticorpos contra M. hyopneumoniae).
A típica tosse seca que acompanha a Pneumonia Enzoótica não aparece imediatamente após a infecção. Parece demorar no mínimo 10 a 16 dias para que a tosse comece a aparecer em um grupo de animais inoculados experimentalmente (Ross, 1999). A tosse fica aparente nos animais por até 60 – 70 –ias após a infecção e depois cessa (Fano et al., 2005; Pieters et al., 2009). É importante observar que a tosse não pode ser usada como único indicador da doença, já que ela não é um sinal patognomônico da infecção. Também é importante lembrar que a ausência de tosse não pode ser traduzida como ausência de potencial para infecção, já que material genético de M. hyopneumoniae foi identificado em suabes nasais de animais infectados experimentalmente durante o período de incubação, antes do aparecimento da tosse (Pieters and Pijoan, 2006), e esses animais são capazes de transmitir o patógeno a sentinelas não infectados vários meses após o desaparecimento dos sinais de tosse no grupo (Pieters et al., 2009).
Os anticorpos contra M. hyopneumoniae não se desenvolvem nos suínos infectados experimentalmente até após 2 a 6 semanas, e esse processo varia dependendo da via de infecção e da dose infectante, (Fano et al., 2005; Marois et al., 2010), respectivamente. No estudo conduzido por Fano, a comparação entre animais infectados por inoculação, contato direto e contato indireto mostrou um atraso na soroconversão na ordem mencionada dos grupos experimentais. Animais infectados por via intra-traqueal podem permanecer soropositivos por até 9 meses (último período de tempo avaliado no experimento), mesmo quando os suínos não estão mais eliminando a bactéria (Pieters et al., 2009).
O M. hyopneumoniae é um patógeno que sob condições normais fica contido no trato respiratório e não produz uma infecção sistêmica. Entretanto, a detecção de anticorpos por ELISA é realizada em amostras de soro. Existe pouca correlação entre anticorpos circulantes e a proteção contra a doença, e um resultado positivo no ELISA é considerado indicativo de exposição ao antígeno, o que pode ser resultado de uma infecção ou da vacinação. Atualmente não existe nenhum ELISA comercial que consiga diferenciar animais vacinados de não vacinados. Há estudos publicados sobre a utilização do teste de ELISA para a detecção da Ig-A secretada em lavados broncoalveolares (Feng et al., 2010). Os autores sugeriram que a detecção dessa Ig-A secretada no fluído broncoalveolar os permitiu diferenciar entre animais vacinados e infectados em amostras de casos de campo.
Outra maneira de identificar a presença e quantificar o efeito do M. hyopneumoniae em um plantel é classificar as lesões pulmonares (Pointon, 1999). Lesões pulmonares macroscópicas podem aparecer em animais infectados experimentalmente já na primeira semana após a infecção (Underdahl et al., 1980) e elas tendem a cicatrizar com o tempo, mesmo quando os animais permanecem infectados e são capazes de transmitir o microorganismo para animais não expostos (Pieters et al., 2009). Mesmo assim, a técnica de classificação das lesões pulmonares é subjetiva por natureza e implica na avaliação post-mortem. Vale notar que as lesões pulmonares não são patognomônicas e precisam ser confirmadas com avaliação microscópica de amostras de tecidos e detecção do M. hyopneumoniae nos pulmões.
Ensaios moleculares (como PCR) constituem maneiras rápidas e confiáveis de detectar o material genético do M. hyopneumoniae em uma gama de amostras, incluindo suabes coletados ao longo do trato respiratório (das cavidades nasais aos brônquios), lavados broncoalveolares e tecidos pulmonares. Entretanto, a sensibilidade do ensaio varia de acordo com o tipo de material usado para a extração do material genético. Pesquisas mostraram de maneira consistente que a maior sensibilidade é observada com amostras de suabes bronquiais, lavados broncoalveolares ou amostras de tecidos dos pulmões (Sibila et al., 2004; Fablet et al., 2010), o que significa que normalmente a necropsia continua sendo necessária. Outra fonte de variação na sensibilidade é o tempo entre a infecção e a coleta das amostras, já que as fases aguda e crônica da infecção possuem padrões de eliminação diferentes. Por exemplo, um suabe nasal coletado de um suíno que está infectado há 1,5 meses (fase aguda) tem uma sensibilidade maior do que esse mesmo tipo de amostra coletada 6 meses após a infecção. O PCR feito a partir do suabe bronquial tem uma sensibilidade alta em ambas as fases da infecção.
Ao longo das últimas décadas foi gerado um corpo de evidências que sustenta a hipótese de que existe uma heterogeneidade de cepas de M. hyopneumoniae (Frey et al., 1992; Vicca et al., 2003; Calus et al., 2007; Vranckx et al., 2011), e uma limitação dos testes baseados em PCR é a potencial falha na detecção de certos isolados da bactéria. Estudos comparativos identificaram provas que, com base no desenho do primer, incluem as áreas mais conservadas no genoma, sendo, portanto, capazes de detectar amostras positivas de múltiplos isolados (Strait et al., 2008)
Também foram desenvolvidas e validadas técnicas de PCR para quantificar a carga de M. hyopneumoniae em amostras clínicas (Dubosson et al., 2004; Marois et al., 2010). Mais recentemente, testes isotérmicos, como por exemplo a técnica LAMP de amplificação isotérmica (Rovira et al., 2008), foram desenvolvidos para permitir uma detecção menos cara, e ainda assim com boa sensibilidade, de antígenos do M. hyopneumoniae; essas técnicas podem inclusive ser adaptadas para laboratórios de diagnósticos de todo o mundo, que dispõe de menos equipamentos.
Uma questão que continua latente quanto a métodos de detecção baseados em PCR é a incapacidade de se diferenciar células viáveis e mortas na amostra analisada, já que um pequeno pedaço de material genético de uma célula morta pode desencadear a amplificação exponencial do PCR gerando um resultado positivo. Para contornar essa questão existem experimentos ou bioensaios de transmissão usando suínos não expostos ao agente (naive), mas essas técnicas são caras, levam tempo e requerem instalações de isolamento.
A infecção por M. hyopneumoniae é caracterizada por evolução lenta e persistência longa. Essas duas características tem um efeito importante sobre a apresentação clínica, eliminação da bactéria e detecção do patógeno e suas lesões. Um bom entendimento da dinâmica da infecção por M. hyopneumoniae constitui a base para uma coleta de amostras adequada e para a interpretação dos resultados dos testes diagnósticos.
A vigilância da infecção por M. hyopneumoniae em condições de campo pode ser um processo estressante e incerto tanto para veterinários quanto para laboratórios de diagnósticos, já que ainda não existe nada publicado em termos de qual é o melhor plano de ação ou melhor caminho a seguir. É necessário que haja unificação de critérios sobre quando e onde coletar as amostras e sobre a melhor maneira de analisá-las. Dessa forma, como foi feito com outras doenças dos suínos, poderiam ser estabelecidas diretrizes para o diagnóstico.
Mais de 45 anos após sua identificação como patógeno de suínos, o M. hyopneumoniae continua sendo o agente causador de uma doença importante em um número elevado de granjas em todo o mundo. Talvez, devido a essa natureza evasiva do M. hyopneumoniae ele tenha conseguido persistir nos rebanhos suínos por tanto tempo. Tecnologias mais modernas e novas informações que poderiam ajudar a solucionar o problema da infecção por M. hyopneumoniae estão sendo publicadas e aplicadas em diferentes áreas da ciência. Por exemplo, o uso de ferramentas moleculares para pesquisar a heterogeneidade dentre os isolados, ou identificação das vias metabólicas que a bactéria não possui e que poderiam melhorar os métodos bacteriológicos de controle. Cabe à suinocultura como um todo, cabe aos veterinários e à comunicado de pesquisa, trabalharem lado a lado para ampliar o conhecimento sobre ecologia desse patógeno, o que poderia resultar em uma maneira mais eficiente de detectar e posteriormente controlar o M. hyopneumoniae.
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