Pontifícia Universidade Católica de Goiás Departamento de Biologia Prof. Hugo Henrique Pádua M.Sc. Fundamentos de Biofísica. - PDF
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Juan João Lucas de Sintra Pedroso
1 Pontifícia Universidade Católica de Goiás Departamento de Biologia Prof. Hugo Henrique Pádua M.Sc. Fundamentos de Biofísica Eletroforese
2 Introdução a Eletroforese Eletroforese migração de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em campo elétrico. Na rotina laboratorial os suportes podem ser: Gel de agarose Gel de poliacrilamida A migração das partículas depende do seu tamanho e carga, além da DDP a que foram submetidas
3 Introdução a Eletroforese Técnica de separação de partículas de DNA, RNA ou proteínas, através da aplicação de uma diferença de potencial (corrente elétrica) as partículas são separadas de acordo com o tamanho (massa)
4 Introdução a Eletroforese Acetato de celulose Gel de agarose Gel de amido Gel de poliacrilamida Eletroforese capilar
5 Eletroforese em gel Introdução a Eletroforese Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas de acordo com o seu tamanho. Gel de poliacrilamida Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas Gel de agarose Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas e partículas grandes O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólo positivo Quanto mais concentrado o gel, mais fechada é sua malha, portanto a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la
6 Eletroforese em gel A amostra é inserida nos pocinhos Partículas de menor tamanho ou carga mais negativa corre primeiro Uma corrente elétrica é aplicada
7 Eletroforese em gel
8 CORRENTE ELÉTRICA: A passagem da corrente elétrica através de uma solução segue a lei de Ohm, na qual: V = R. I V = voltagem, R = resistência e I = amperagem Para que a técnica funcione, deve ser desenvolvida sob voltagem (V), corrente (I) e potência (W) constantes. VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO: * Diretamente proporcional: ao campo elétrico e à carga líquida. * Inversamente proporcional: ao raio, à distância entre os dois eletrodos e à viscosidade.
9 VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS PROTEÍNAS: corante coomasie blue ENZIMAS: solução específica (substrato, coenzimas, solução-tampão e sais) DNA e RNA: vários sistemas de revelação, tais como: - Fluorescência (Brometo de Etídio); - Radioatividade; - Nitrato de prata;
10 VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS Quando submetidas a luz UV o gel apresenta um padrão de bandas. Cada banda é um fragmento de DNA de determinado tamanho. O ladder é formado por diferentes tamanhos de DNA e serve como marcador de peso molecular
11 AGAROSE POLIACRILAMIDA COMPOSIÇÃO Pó matriz AGA (Alga marinha) Acrilamida (I) + Bisacrilamida (T) CARACTERÍSTICAS Malha frouxa Malha complexa OBJETIVO Longos fragmentos Deleção de bases SOLIDIFICAÇÃO minutos 24 horas
12 Eletroforese em gel Brometo de etídio Agente intercalante do DNA Cancerígeno! Composto fluorescente à luz UV Nitrato de prata Gel Red
13 Eletroforese em gel de agarose A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga marinha vermelha; Dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria; Mais utilizada para separação de fragmentos longos de DNA
14 Eletroforese em gel de agarose É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá manter estáveis as condições de ph do meio
15 Visualização do gel de agarose em luz UV
17 Eletroforese Eletroforese em gel Marcadores de peso molecular são usados para estimar o tamanho das moléculas das amostras. 17
18 GEL DE AGAROSE
33 Eletroforese em gel de poliacrilamida A poliacrilamida também pode ser utilizada com gel para a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida; Utilizada para observação de fragmentos menores (poucos pares de bases ou proteínas); Melhor resolução do que a eletroforese em gel de agarose; Desvantagem: Neurotóxica
34 Eletroforese em gel de poliacrilamida É realizada em uma cuba de eletroforese vertical.
35 Eletroforese em gel de poliacrilamida
36 Eletroforese em gel de poliacrilamida Gel de poliacrilamida 36
37 GEL DE POLIACRILAMIDA
40 Gel acrilamida
52 Eletroforese: métodos de leitura Densitometria 52
53 Aplicações Identificação de pessoas: em testes de paternidade, comparando o DNA do suposto pai, da mãe e do filho. Na identificação de criminosos. Na Industria farmacêutica (vacinas, reagentes de diagnóstico). Na agropecuária (animais e plantas transgênicos).
54 Aplicações Na rotina: Análise do paciente Pesquisa genética Conduta terapêutica Prognóstico Aconselhamento
55 Fatores determinantes Tamanho da molécula Tipo de molécula Concentração Conformação do DNA Voltagem Tampão (TAE, TPE, TBE, PBS, etc)