SciELO - Brazil - Atividade antimicrobiana do óleo essencial de rizomas de açafrão (Curcuma longa L.) e gengibre (Zingiber officinale Roscoe) frente a salmonelas entéricas isoladas de frango resfriado Atividade antimicrobiana do óleo essencial de rizomas de açafrão (Curcuma longa L.) e gengibre (Zingiber officinale Roscoe) frente a salmonelas entéricas isoladas de frango resfriado
• Rev. bras. plantas med. 16 (3) • Set 2014 • https://doi.org/10.1590/1983-084X/13_109 copiar
Atividade antimicrobiana do óleo essencial de rizomas de açafrão (Curcuma longa L.) e gengibre (Zingiber officinale Roscoe) frente a salmonelas entéricas isoladas de frango resfriado
C. Majolo
E.C. Chagas
plantas medicinais; antimicrobianos naturais; sorovares de Salmonella
medicinal plants; natural antimicrobials; Salmonella serovars
Majolo, C.I, II, * * E-mail: claudia.majolo@embrapa.br ; Nascimento, V.P.II; Chagas, E.C.I; Chaves, F.C.M.I
IEMBRAPA Amazônia Ocidental, AM 10, Km 29, zona rural, Caixa Postal 319, Manaus/AM, 69010-970, Brasil
IIPrograma de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves 9090, Porto Alegre, RS 91540-000, Brasil
Palavras-chave: plantas medicinais, antimicrobianos naturais, sorovares de Salmonella.
Keywords: medicinal plants, natural antimicrobials, Salmonella serovars.
As enfermidades transmitidas por alimentos (ETA´s) constituem-se uma preocupação para a área da saúde pública. Em países desenvolvidos, que possuem um bom sistema de vigilância epidemiológica, tem-se observado aumento significativo na incidência das mesmas (MMRW, 2004; 2008), sendo a Salmonella, um dos patógenos mais envolvidos em casos destas ETA´s (WHO, 2010).
Diversos estudos epidemiológicos indicam os alimentos de origem animal, como um dos maiores veículos na transmissão de enfermidades causadas por Salmonella, tendo a carne de frango, particular importância na transmissão deste patógeno (Whyte et al., 2002; Cretikos et al., 2008; Scallan et al., 2011).
Durante os últimos anos, o limite de infecções por Salmonella foi excedido drasticamente e este micro-organismo tornou-se um desafio na indústria de alimentos, devido a sua distribuição generalizada em todo o mundo, não sendo apenas responsáveis por infecções leves a graves, mas também podendo causar infecções fatais (Bajpal et al., 2012)
O aumento de infecções alimentares provocadas pelos sorotipos de Salmonella ocorre principalmente devido ao desenvolvimento de novas características específicas, tornando-as capazes de se adaptar em qualquer condição ambiental. Salmonelas resistentes à antibióticos comerciais tem emergido como uma grande preocupação de saúde para os consumidores revelando que a infecção por salmonelas resistentes a antibióticos tem desempenhado um papel vital para o aumento da taxa de ETA´s (Bajpal et al., 2012).
Segundo Haida et al. (2007), a procura de novos antimicrobianos a partir de espécies vegetais, tem se mostrado bastante expressiva nos últimos anos, visando solucionar os problemas da resistência microbiana a antibióticos atualmente utilizados.
Originalmente utilizadas para alterar ou melhorar o sabor dos alimentos, as ervas e especiarias possuem metabólitos secundários, como os óleos essenciais, que desempenham papel protetor de plantas contra agentes infecciosos como bactérias (BakkaliI et al., 2008), sendo consideradas importantes substâncias bioativas (Shao et al., 2011).
A busca de garantias para a segurança alimentar e, concomitantemente, o atendimento às demandas para conservação e qualidade, vem impulsionando a pesquisa para o desenvolvimento de métodos alternativos na conservação de alimentos. Essas crescentes demandas abrem novas perspectivas para o uso de conservantes naturais, dentre eles, os derivados de plantas (TiwariI et al., 2009). Dentre estes derivados, os óleos essenciais de Curcuma longa L. e Zingiber officinale Roscoe tem sido estudados para este propósito.
Curcuma longa L., conhecida popularmente como açafrão ou açafrão da Índia, é uma planta originária da Índia e cultivada em todo mundo tropical (Lorenzi & Matos, 2002).
Da sua raiz seca e moída se extrai o pó, utilizado na culinária como condimento ou corante de cor amarela e brilhante, e no preparo de medicamentos. Em sua composição química, o principal constituinte é a curcumina, possuindo também óleo essencial de excelente qualidade técnica e organoléptica, que, juntos, possibilitam estender sua utilização também aos mercados de perfumaria e têxtil (Cecílio Filho, 2000).
Estudos demonstram que o óleo essencial de Curcuma longa L. apresenta poder antimicrobiano em potencial contra diferentes patógenos alimentares incluindo diferentes sorovares de Salmonella (Franco et al., 2007; Péret-Almeida et al., 2008; Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn, 2010).
Zingiber officinale Roscoe conhecido como gengibre, possui rizoma ramificado, de cheiro e sabor picante, agradável (Lorenzi & Matos, 2002), apresenta forte atividade antimicrobiana sendo amplamente utilizada como especiaria da culinária além de ser bem conhecido na medicina tradicional (Yadav et al., 2012).
Estudos realizados com seus óleos essenciais e extratos de gengibre frente a diversos patógenos alimentares verificaram excelente atividade antimicrobiana, incluindo atividade contra diferentes sorovares de Salmonella (Sa-Nguanpuag, 2011; YousufiI, 2012; Ahmed, 2012).
O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar e quantificar os constituintes dos óleos essenciais de Curcuma longa L. e Zingiber officinale Roscoe cultivados nas condições edafoclimáticas de Manaus - AM e avaliar sua atividade antimicrobiana frente a 14 salmonelas isoladas de amostras de frango resfriado.
Foram utilizados 14 cepas de Salmonella enterica, isolados de frango resfriado, incluindo os sorovares: Schwarzengrund (2), Heidenberg (1), Mbandaka (3), Enteritidis (2), Typhimurium (1), Agona (1) e 4 isolados sem identificação possível, apenas confirmando a subespécie enterica.
Os óleos essenciais avaliados foram obtidos a partir rizomas de Curcuma longa L. (açafrão) e de Zingiber officinale Roscoe (gengibre) cultivados no Setor de Plantas Medicinais da Embrapa Amazônia Ocidental, município de Manaus/AM, situada a 03º 06' 23,04"S e 60º 01' 35,14"W. A altitude média é de 50 metros e temperatura média de 25,6°C, com precipitação média de 2.200 mm anual. O clima é do tipo "Afi", segundo classificação de Köppen (RIBEIRO, 1976).
Após oito meses de cultivo (do plantio a colheita) quando as folhas estavam amareladas, acamadas (agosto de 2012) foi feita a colheita dos rizomas de ambas as espécies, sendo em seguida colocados para secar à temperatura ambiente, à sombra, em galpão telado. Decorridos cinco dias foram peneirados para retirada de resto de solo e em seguida foram encaminhados para o Laboratório de Plantas Medicinais e Fitoquímica, também da Embrapa. Os rizomas foram cortados em fatias bem finas para facilitar a extração de óleo essencial que foi realizada através de hidrodestilação utilizando o aparelho do tipo Clevenger. O óleo foi separado da fase aquosa e seco com Sulfato de Sódio (CRQ, Diadema, São Paulo, Brasil), filtrado e armazenado em recipientes de vidro opaco, mantendo-se à temperatura de 8 °C até o momento da sua utilização.
Para avaliação da composição química dos óleos essenciais das espécies supracitadas, foi utilizado um cromatógrafo a gás Agilent (Palo Alto, USA) 7890A equipado com coluna capilar HP-5 (5%- difenil-95%-dimetilsilicone, 30m X 0,32mm X 0,25µm). A programação de temperatura do forno foi de 60 a 240 ºC, a 3 ºC/min, usando-se hidrogênio como gás carreador (1,5 mL.min-1). Foi injetado 1,0 µL de uma solução 1% do óleo essencial em Diclorometano (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) no modo com divisão de fluxo (1:100; injetor a 250 ºC). Os espectros de massa foram obtidos em um sistema Agilent 5973N operado no modo impacto de elétrons (EIMS) a 70 eV, acoplado a um cromatógrafo Agilent 6890 equipado com coluna HP-5 MS (5%-difenil-95%-dimetilsilicone, 30m x 0,25mm x 0,25mm), usando o mesmo procedimento de injeção e programa de temperatura como descrito acima. O hélio foi o gás carreador (1,0 mL.min-1). Os índices de retenção foram calculados a partir dos tempos de retenção dos componentes dos óleos e aqueles de uma série de n-alcanos (C7-C26). A identificação dos constituintes foi realizada por comparação entre os espectros de massa obtidos e os dados de biblioteca espectral (Wiley 6th ed.), e através do índice de retenção calculado e comparado com valores publicados (Adams, 2007).
A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de açafrão e gengibre foi determinada pelo método de microdiluição em caldo utilizando placas contendo 96 poços, conforme NCCLS (M7-A6) (NCCLS, 2003), sendo determinadas a CIM e a CBM. Em cada placa foram aplicados os óleos essenciais nas concentrações testadas, o antimicrobiano Cloranfenicol (Flucka BioChemika, St. Gallen, Switzerland) e o diluente Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), todos em triplicata. Também foram feitos controles negativos (meio sem adição de inóculo) e controles positivos (meio com adição de inóculo).
Para o óleo essencial de gengibre, pesou-se 0,2 g de óleo em 1 mL de DMSO. Desta forma foi obtida uma solução de 200.000 µg.mL-1 (solução estoque). Para o óleo de açafrão, a quantidade de óleo para preparo da solução estoque foi aumentada proporcionalmente em função da observação de não atividade nas mesmas condições que o gengibre.
O padrão de antibiótico utilizado para verificação da atividade antimicrobiana foi o cloranfenicol 0,2 µg.mL-1.
Inicialmente foram transferidas alíquotas de 200 µL do inóculo padronizado (108 unidades formadoras de colônia (UFC) mL-1) a tubos de ensaio contendo 10 mL de Tryptone Soya Broth (TSB) (Himedia, Mumbai, India). Para o óleo essencial utilizou-se o TSB com 1% do surfactante Tween 80 (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil).
Para todos os poços da placa foram adicionados 100 µL do meio acrescido de inoculo com exceção da última linha (controle do meio).
As primeiras colunas foram destinadas aos óleos essenciais e as demais ao cloranfenicol e ao meio acrescido do diluente DMSO.
Para o óleo essencial de gengibre foi efetuada uma diluição da solução estoque, onde foi adicionado 1 mL da solução estoque em 4 mL de TSB contendo 1% do surfactante Tween 80, resultando dessa forma em uma solução com concentração de 40.000 µg.mL-1. Desta solução foram retirados 100 µL e adicionados em três poços da primeira linha; da mesma forma, foram aplicados 100 µL do antimicrobiano cloranfenicol e DMSO diluído em TSB (controle do diluente), obtendo-se assim 200 µL nos poços da linha A.
As diluições foram realizadas homogeneizando-se os primeiros poços com as amostras, transferindo 100 µL para os próximos poços, e assim, sucessivamente, até a antepenúltima linha, obtendo-se as concentrações finais de 20000, 10000, 5000, 2500, 1250 e 625 µg.mL-1 para o óleo essencial de gengibre, 320000, 160000, 80000, 40000, 20000 e 10000 µg.mL-1 para o óleo essencial de açafrão e de 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125, 0,00625 e 0,003125 µg.mL-1 para o cloranfenicol.
Logo após a micropipetagem, as placas foram fechadas e incubadas a 35ºC +/- 1 ºC por 24 horas.
Após o tempo de incubação, realizou-se a leitura das placas. A confirmação de crescimento bacteriano foi representada pelo poço turvo e a ausência de crescimento foi representada pelo poço límpido. O primeiro poço onde não se observou crescimento (de menor concentração) correspondeu ao valor da concentração inibitória mínima (CIM).
A confirmação de crescimentos nos poços foi realizada por meio da aplicação da solução aquosa estéril de Cloreto de Trifeniltetrazólio 0,5% (TTC) (Nuclear-CAQ, Diadema, SP, Brazil), revelada pelo aparecimento de uma cloração avermelhada.
Para determinação da CBM dos óleos essenciais foram realizadas semeaduras em placas de Tryptone Soya Agar (TSA) (Himedia, Mumbai, India), de todos os poços onde não havia revelação de crescimento bacteriano. Essas placas foram incubadas a 35 ºC +/- 1 ºC por 24 horas.
Após o período de incubação, observou-se o crescimento bacteriano, registrando-se a menor concentração dos óleos essenciais que não evidenciaram crescimento em placas.
Para a avaliação dos dados foi realizada a análise de variância e teste de médias pelo método de Duncan (nível de significância com 5% de probabilidade) para avaliar se os diferentes isolados de Salmonella enterica em estudo, apresentavam perfis de suscetibilidade semelhantes ou não, frente a determinado óleo essencial.
Os resultados da composição química dos óleos essenciais de Curcuma longa L. (açafrão) e Zingiber officinale Roscoe (gengibre) estão apresentados nas Tabelas 1 e 2.
Para o óleo essencial de açafrão foram identificados 19 constituintes, o que representa cerca de 68,2% do óleo essencial, sendo os compostos majoritários: ar-tumerona (17,9%), alfa-tumerona (14,6%) e 1,8-cineol (14,2%) (Tabela 1). No óleo essencial de gengibre foram identificados 20 constituintes, representando 98,3% do óleo essencial, sendo o geranial (23,9%), neral (17,2%), 1,8-cineol (16,0%) e canfeno (11,4%) os compostos majoritários (Tabela 2).
A atividade antibacteriana dos óleos essenciais de açafrão e gengibre, obtidas por microdiluição em caldo, expressas como CIM e CBM estão descritas na Tabela 3.
Não foi possível fazer a análise estatística dos resultados de CIMs e CBMs dos óleos essenciais de açafrão e gengibre, pois o óleo essencial de açafrão apresentou em sua maioria, valores indeterminados. Entretanto, verifica-se expressiva diferença quanto à atividade bactericida (CBM) e bacteriostática (CIM), revelando a superioridade em termos de atividade do óleo essencial de gengibre.
Para o óleo de açafrão a variação da CIM foi de 80000 a >320000 µg.mL-1 e a CBM variou de 160000 a >320000 µg.mL-1 (Tabela 3). Independentemente do sorovar de Salmonella avaliado, a resistência ao óleo essencial de açafrão foi alta.
Para a atividade antibacteriana a menor concentração do óleo essencial de açafrão capaz de inibir 50% dos isolados (CIM 50% e CBM 50%) foi superior a 320000 µg.mL-1, tornando a determinação inconclusiva, comprovando a fraca atividade deste óleo essencial, em termos de ação bacteriostática como bactericida.
Quanto à composição química, Gounder & Lingamalle (2012) também encontraram αr-tumerona e α-tumerona como compostos majoritários em óleo de açafrão, porém, em maiores concentrações, 21,0% e 33,5% respectivamente.
Singh et al. (2011), encontraram αr-tumerona e curlona como componentes majoritários do óleo essencial de açafrão, apresentando excelente atividade frente à Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Aspergilus niger. Os autores justificam a atividade em função da elevada concentração de αr-tumerona.
Nanasombat & Lohasupthawee (2005) avaliando extrato etanólico de açafrão não observaram atividade antibacteriana frente a 20 diferentes sorovares de Salmonella enterica, resultado similar ao do presente trabalho.
Franco et al. (2007), avaliando a ação antibacteriana com discos impregnados e difusão em ágar do óleo essencial de açafrão, não constatou atividade frente à Salmonella Choleraesuis, sendo que o óleo apresentava como componente majoritário a tumerona (28,67%), coincidindo com os resultados deste trabalho.
De Bona et al. (2012) avaliaram extrato de açafrão frente a 14 sorovares de Salmonella isolados de frango, sendo que a CIM para Salmonella MBandaka, Salmonella Heidelberg e Salmonella Lexington foi 100, 150 e 200 µg.mL-1 respectivamente, entretanto, a determinação de composição química destes extratos não foi realizada.
Para o óleo essencial de gengibre a variação da CIM foi de 2500 a 5000 µg.mL-1 e a CBM variou de 5000 a 10000 µg.mL-1 (Tabela 3).
Dentre os sorovares avaliados as amostras que apresentaram resistência semelhante entre eles e maior em relação às demais foram: 11 (Salmonella Schwarzengrund), e 9 (sem identificação) (p<0,05) (Tabela 3). A amostra 9 também apresentou menor CIM entre todas as amostras.
No que diz respeito à composição química do óleo essencial de gengibre resultados semelhantes a este trabalho foram relatados por Singh et al. (2008) onde o composto majoritário encontrado foi o geraniale. Mesomo et al. (2013), encontraram como compostos majoritários α-curcumeno, geranial e canfeno, e, avaliando halos de inibição frente a Salmonella typhimurium, encontraram atividade fraca a moderada
Sa-Nguanpuag et al. (2011) avaliaram a ação antimicrobiana de óleo essencial de gengibre obtido por duas formas: hidrodestilação e extração por solventes, sendo que para os sorovares de Salmonella avaliados, o óleo essencial obtido por hidrodestilação, apresentou melhor ação antimicrobiana (2,5 a 10 mg.L-1) enquanto que ao ser avaliada através de discos de difusão, os resultados foram muito inferiores ao obtido no presente trabalho.
De Bona et al. (2012), avaliaram extrato de gengibre frente a 14 sorovares de Salmonella isolados de frango, sendo que a CIM para Salmonella Montevedeo foi de 200 µg.mL-1, não sendo observada a inibição de nenhum outro dos sorovares testados.
A composição química dos óleos testados foi variável com os dados relatados na literatura, o que pode ser explicado devido a influência de diversos fatores, tais como: ambiente, estádio de desenvolvimento ou idade da planta (Oliveira et al., 2012), podendo também justificar a variação de resultados de CIM e CBM relatados em comparação a outros estudos.
Trabalhos avaliando a ação de óleos essenciais de gengibre e de açafrão evidenciaram a ação antibacteriana mais efetiva frente a bactérias Gram-positivas (Sa-Nguenpuag, 2011; Ahmed, 2012; Shanoon, 2012). Sendo a Salmonella uma bactéria Gram-negativa, apresenta maior resistência do que outras espécies Gram-positivas (Preuss, 2005), podendo ser justificada pela dupla camada fosfolipídica, que protege a célula bacteriana de determinadas classes de compostos presentes nos óleos essenciais (Oussalah, 2007).
A falta de padronização das técnicas empregadas resulta em grandes variações nas CIM´s e CBM´s mesmo quando da utilização de óleos de composição similar.
Os resultados desta pesquisa permitiram evidenciar superioridade da atividade do óleo essencial de gengibre em comparação ao de açafrão frente a salmonelas entéricas isoladas de frango, bem como a variação de susceptibilidade dos diferentes sorovares confrontadas.
Sendo o gengibre uma especiaria amplamente utilizada no preparo de pratos a base de carne de frango, sugerem-se estudos adicionais abordando o sinergismo entre o óleo essencial desta espécie e a matriz alimentar em questão, bem como a avaliação em termos organolépticos para mensuração da aceitação por consumidores das doses consideradas efetivas.
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Aceito para publicação em 11/03/2014
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