Diversidade genética de aceroleiras (Malphigia emarginata D.C.), utilizando marcadores moleculares RAPD e características morfoagronômicas
http://dx.doi.org/10.1590/S0100-29452009000100023
Diversidade genética de aceroleiras (Malphigia emarginata D.C.), utilizando marcadores moleculares RAPD e características morfoagronômicas1
Genetic diversity of barbados cherry (Malphigia emarginata D. C.), with RAPD molecular markers and morpho-agronomical characteristics
Marcos Góes OliveiraI; Jurandi Gonçalves de OliveiraII; Aroldo Gomes FilhoI; Messias Gonzaga PereiraII; Alexandre Pio VianaII; Gonçalo Apolinário de Souza FilhoIII; Guilherme Eugênio Machado LopesIV
IPós-graduando em Genética e Melhoramento de Plantas - CCTA/UENF. E-mail: marcosgoes32@hotmail.com
IIProfessor Associado do Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal - CCTA/UENF. E-mail: jugo@uenf.br
IIIProfessor Associado do Laboratório de Biotecnologia - CBB/UENF
IVPesquisador da Pesagro-Rio - Estação Experimental de Itaocara, RJ
O conhecimento da variabilidade genética e da relação entre diferentes acessos de aceroleira é importante para maximizar o uso dos recursos genéticos para futuros programas de melhoramento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a divergência genética entre 48 acessos de aceroleira, por meio de marcadores moleculares RAPD e características morfoagronômicas. Foram utilizados 25 iniciadores, possibilitando obter 108 marcadores, sendo observadas 92 marcas polimórficas. Os marcadores obtidos foram analisados, usando os métodos de otimização de Tocher e hierárquico UPGMA, que gerou um dendrograma utilizando o índice de Jaccard. Os resultados mostraram uma concordância parcial entre os métodos de agrupamentos estudados, com a formação de 14 grupos. Os acessos ACE 023 e ACE 033 foram os mais distintos, apresentando distância genética de 0,58. A análise comparativa dos agrupamentos revelou que os marcadores RAPD, associados com características morfoagronômicas, foram eficientes para a discriminação dos acessos e que houve uma variabilidade genética potencial para o programa de melhoramento genético e informações úteis, como a indicação de acessos promissores para avaliação clonal.
Termos para indexação: polimorfismo; teor de ácido ascórbico; variabilidade genética.
The knowledge on genetic variability and the relationship among different Barbados cherry accesses is important to maximize the resources for the future genetic breeding. The objective of this work was to determine the genetic variability among 48 accessions of Barbados cherry evaluated using RAPD as DNA markers and morpho-agronomical characteristics. It was used 25 primers, making it possible to obtain 108 markers and to generate 92 different polymorphic products. The obtained markers were of analyzed by the method of Tocher and UPGMA what generated a dendrogram using the Jaccard index. There was a concordance among the studied methods with the formation of 14 groups. The accessions ACE 023 and ACE 033 were the most distinct, presenting a genetic dissimilarity of 0.58. The results allowed to us to conclude that RAPD marker associated with morpho-agronomical characteristics were efficient to discriminate the genetic relationship among the accessions of Barbados cherry and the divergent accessions should be useful in the use of genetic breeding and six of them were recommended for future clonal evaluation as varieties and clonal propagation.
Index terms: polymorphic,acid ascorbic content, genetic variability.
No Brasil, a aceroleira (Malpighia emarginata D.C.) é conhecida há mais de 50 anos. Porém, somente no início dos anos 80 a cultura mostrou uma considerável expansão na área de cultivo, devido ao interesse comercial pelos seus frutos, que possuem alto teor de ácido ascórbico (Neto et al., 1995), a principal forma biologicamente ativa de vitamina C.
O fruto da aceroleira apresenta em média entre 1.000 e 5.000 mg de ácido ascórbico por 100g de polpa (Tavares et al., 2003), sendo o produto amplamente utilizado na indústria farmacêutica e de alimentos.
Nos pomares brasileiros, observa-se alta variabilidade entre os materiais cultivados no que se refere a importantes características como produtividade, hábito de crescimento e porte da planta, arquitetura da copa, cor, sabor, consistência e tamanho do fruto, além do rendimento de polpa, entre outras, resultado da propagação seminal (Paiva et al., 1999). Esta alta variabilidade dos materiais genéticos vem acarretando sérios problemas ao sistema de produção, pois dificulta a execução racional de todas as práticas culturais, desorganizando, principalmente, o sistema de comercialização do produtor, com prejuízos para os produtores.
Por outro lado, a ocorrência desta variabilidade entre os genótipos cultivados nos pomares brasileiros pode ser explorada em programas de melhoramento vegetal, na seleção de indivíduos superiores ou como base para a geração de híbridos, com características de interesse do mercado consumidor, bem como materiais mais bem adaptados às diversas regiões produtoras do País.
Os marcadores moleculares tipo RAPD (amplificação arbitrária polimórfica de DNA) são trata de uma técnica rápida e de custo relativamente baixo, porém com potencial informativo (Willians et al., 1990). Têm sido empregados para estudos de diversidade genética de algumas frutíferas como aceroleira (Salla et al., 2002), bananeira (Souza, 2006), açaizeiro (Oliveira et al., 2007) e maracujazeiro (Viana et al., 2003).
A Empresa de Pesquisa Agropecuária do Estado do Rio de Janeiro - Pesagro-RIO, em sua estação experimental de Itaocara, possui uma população de aceroleiras de cerca de 14 anos com grande potencial para estudos relacionados à implantação desta espécie no Estado do Rio de Janeiro e em outras regiões do País. Esse pomar é constituído de 48 acessos que apresentam alguma variabilidade morfoagronômica e aparente potencial de destaque em alguns indivíduos. Entretanto, quase não há informação a respeito da origem e estrutura genética desses materiais, limitando o uso dessa população como Banco de Germoplasma capaz de serem usados na geração de materiais-elite.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética entre os acessos de uma população de aceroleiras via marcadores moleculares RPAD e descritores morfoagronômicos visando à identificação de genótipos promissores, adequados para utilização em programas de melhoramento da cultura.
Neste trabalho, utilizaram-se 48 acessos com 15 anos de idade (ACE 001 - ACE 048) de uma população de aceroleiras, oriundos do centro de produções de mudas da antiga CATI (Coordenadoria de Assistência Técnica Integral), localizado em São Bento do Sapucaí - SP, e semeados na Estação Experimental da Pesagro-RIO, localizado no município de Itaocara-RJ. O município de Itaocara localiza-se na região noroeste fluminense, situado a 21º 39' 12'' S e 42º 04' 36''W, com uma altitude de 60 m, clima do tipo AWi, com temperatura média anual de 22,5ºC e precipitação média anual de 1.041 mm (Fontes, 2002).
Foram feitas avaliações com base na relação de descritores mínimos para aceroleira (Oliveira et al., 1998), para efeito de comparação entre os acessos, quais sejam: conformação da copa, ramificação da copa, forma geral dos bordos da corola, coloração da casca do fruto imaturo e do fruto maduro, tamanho do fruto maduro e teor de ácido ascórbico (avaliado por titulação com 2,6 diclorofenol-indofenol e expresso em mg de ácido ascórbico/100 g de polpa), conforme o método oficial da A.O.A.C. (1970).
Devido à falta de frutificação inicial dos materiais, tabularam-se apenas 38 acessos que apresentaram todas as características estudadas, enquanto apenas 25 acessos apresentaram frutos suficientes para a realização da análise do teor de ácido ascórbico.
Para a extração do DNA, utilizaram-se 50 mg de folhas jovens coletadas a partir do ápice das plantas. O protocolo adotado para extração segue o descrito por Doyle & Doyle (1987).
Vinte e cinco iniciadores RAPD foram utilizados nas reações de amplificação de PCR (reação de polimerase em cadeia), conforme especificados a seguir: OPA 13, OPAB 01, OPAB 09, OPAB 11, OPAB 13, OPAE 03, OPAE 14, OPAE 16, OPAE 17, OPAF 13, OPAF 20, OPAR 03, OPAX 09, OPAX 10, OPAX 11, OPAX 14, OPAX 15, OPAX 16, OPI 02, OPI 03, OPI 05, OPI 06, OPI 07, OPI 10 e OPI 11.
As reações de amplificação dos fragmentos de DNA foram feitas num volume final de 20µL contendo: 10,80 µL de água ultrapura; 2µL de tampão de amplificação (100 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl); 1,60 µL de MgCl2 (25 mM); 1,0 µL de DNTPs (2 mM de cada um dos desoxiribonucleotídeos dATP, dTTP, dCTP, dGTP); 2,0 µL de iniciador (5 mM); 2,0 µL de DNA genômico, numa concentração final de 10 ng/µL; e 0,6 unidade de Taq de DNA polimerase. As reações foram conduzidas em termociclador modelo Martercycler gradient (Eppendorf), e o programa utilizado foi 45 ciclos, consistindo de 1 minuto a 95 ºC, 1 minuto a 36ºC e 2 minutos a 72 ºC, seguida de uma etapa final de 7 minutos a 72 ºC.
Após as reações, os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese (100V por 90 minutos) em gel de Agarose a 2% (p/v), utilizando o tampão TAE 0,5 X. Para efeito de comparação de tamanho dos fragmentos amplificados, foi utilizado como padrão o DNA Ladder 250 bp adquirido da INVITROGEN Life Technologies.
Para a análise dos resultados, foram utilizados os recursos computacionais do programa Genes (Cruz, 2006). A análise estatística foi feita com base na matriz de dados binários formada por meio da análise dos géis de RAPD, onde, para a presença de banda, foi atribuído o valor 1, enquanto à ausência desta foi atribuído o valor zero. A distância genética foi calculada aos pares entre os genótipos, pelo complemento aritmético do índice de Jacard (Cruz & Carneiro, 2003).
Com base na matriz de dissimilaridade, utilizou-se dos métodos de agrupamento de otimização de Tocher e do método hierárquico UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average).
Marcadores RAPD
Utilizaram-se, inicialmente, amostras de DNA de quatro acessos com o objetivo de selecionar os iniciadores mais informativos. Dos 72 iniciadores testados, 25 forneceram produtos nítidos para amplificação. Os iniciadores foram utilizados em toda a população, gerando um total de 92 marcas polimórficas e 16 monomórficas, resultando em uma média entre quatro e cinco bandas polimórficas por iniciador. O número de marcas polimórficas variou de uma a oito por iniciador, totalizando 85,18% de polimorfismo. Segundo Salla et al. (2002), este percentual de fragmentos polimórficos amplificados pode ser considerado suficiente para a avaliação da diversidade genética em aceroleiras. Os iniciadores OPAX 09, OPAX 14, OPAX 16 e OPAB 11 destacaram-se entre os demais, apresentando entre seis e oito marcas polimórficas, mostrando potencial para uso em estudos de diversidade desta espécie.
A partir dos resultados aqui obtidos, verificou-se a ocorrência de diversidade entre os 48 acessos estudados através da técnica de marcadores do tipo RAPD, indicando que esta técnica mostrouse eficaz para identificação de diversidade desta população.
O complemento do coeficiente de Jaccard forneceu a estimativa da dissimilaridade genética entre os acessos avaliados. As dissimilaridades entre os acessos variaram de 0,180 a 0,588, apresentando distância genética média de 0,361. As dissimilaridades mínimas foram registradas entre os acessos ACE 041 e ACE 043. Por outro lado, entre os acessos ACE 023 e ACE 033 e entre ACE 001 e ACE 017, foram observados as maiores dissimilaridades, apresentando uma distância genética de 0,588 e 0,406, respectivamente.
Neste trabalho, não havia conhecimento prévio da variabilidade genética dos progenitores desta população, contudo o nível de diversidade obtido neste estudo sugere que essa população possui alta variabilidade genética. É provável que o alto grau de polimorfismo encontrado nos 48 genótipos esteja relacionado ao fato de esta espécie apresentar características predominantes de planta de fecundação cruzada. Lopes et al. (2002), estudando o polimorfismo isoenzimático de aceroleira, sugerem que o alto grau de polimorfismo observado nesta cultura seja um indicativo de considerável taxa de cruzamento, confirmando a predominância de alogamia da aceroleira. Entretanto, Salla et al. (2002), avaliando a variabilidade genética entre 24 acessos de aceroleiras, por meio de marcadores RAPD, relataram que a variabilidade genética obtida pelos marcadores pode estar relacionada à intensa utilização de sementes na produção de mudas.
Estudos de diversidade sugerem que há uma tendência em germoplasma de plantas arbóreas e arbustivas, alógamas ou autógamas com alta taxa de alogamia, especialmente em aquelas pouco melhoradas apresentarem alto polimorfismo (Oliveira et al., 2007). Dessa forma, há a possibilidade de se obterem ganhos genéticos significativos com o emprego de alguns dos acessos de aceroleiras da Estação Experimental da Pesagro-Rio em futuros programas de melhoramento desta espécie. Os resultados permitem orientar a recomendação de materiais a serem utilizados pelos produtores de aceroleira, com base na divergência genética associada a estudos de características morfológicas de grande interesse nesta cultura, como o teor de ácido ascórbico dos frutos.
A partir das análises de agrupamento pelo método de otimização de Tocher, foi possível separar os 48 acessos em 13 grupos distintos, onde se observa a presença de 35 indivíduos (72,92%) no primeiro grupo (Tabela 02). Este grupo foi então subdividido em subgrupos, resultando na formação de 14 subgrupos distintos. Geralmente, os grupos maiores, formados por grande número de acessos, agrupam os pares que apresentam menores distâncias, uma vez que o tamanho do grupo é delimitado por uma distância média entre os pares de indivíduos. O grupo II foi composto por dois acessos, onde a distância genética observada entre os acessos foi de 0,303. Por outro lado, os demais grupos (III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII e XIII) apresentaram apenas um acesso cada, ACE 025, ACE 026, ACE 020, ACE 018, ACE 029, ACE 001, ACE 028, ACE 017, ACE 030, ACE 024 e ACE 023, respectivamente. De acordo com Vieira et al. (2005), grupos formados por apenas um indivíduo apontam na direção de que tais indivíduos sejam mais divergentes em relação aos demais, como pôde ser observado neste trabalho.
Utilizando o método de agrupamento UPGMA, observou-se a formação de 14 grupos considerando uma dissimilaridade relativa a 34% do ponto de delimitação, onde os resultados evidenciaram que, para os dois métodos de agrupamento, foi possível observar uma concordância parcial entre os resultados. Obteve-se, também, r = 0,82 para correlação cofenética, o que indica bom ajuste (0,8 < r < 0,9) para esta medida de qualidade ou de ajustamento da agregação. Para efeito de comparação entre os acessos, foram utilizados descritores morfoagronômicos, e o principal parâmetro referencial para esta cultura, o teor de ácido ascórbico.
O grupo I foi representado apenas pelo acesso ACE 001, que se destacou dos demais acessos no teor de ácido ascórbico (2.158 mg/100g de polpa), que foi o quarto maior entre todos os outros. Além dessa variável, esse acesso apresentou a copa muito ramificada, a coloração da casca do fruto imaturo foi verde e, quando maduro, arroxeada, e o fruto apresentou ainda tamanho médio.
Verificou-se uma similaridade entre os grupos de acessos para os descritores avaliados (Tabela 01). Dessa forma, o grupo II agregou 47,92% dos acessos, apresentando 23 indivíduos, sendo eles os acessos ACE 035, ACE 034, ACE 014, ACE 042, ACE 038, ACE 008, ACE 006, ACE 036, ACE 012, ACE 040, ACE 010, ACE 043, ACE 041, ACE 005, ACE 044, ACE 037, ACE 045, ACE 003, ACE 013, ACE 032, ACE 019, ACE 015 e ACE 002. Neste grupo, 56,25% dos acessos apresentaram conformação da copa ereta, enquanto 93,75% dos indivíduos apresentaram a copa muito ramificada e folhas com borda ondulada, exceto o indivíduo ACE 002, que apresenta uma copa pouco ramificada, e o indivíduo ACE 010, que apresenta folhas com borda levemente ondulada. Com relação à coloração da casca do fruto imaturo, 75% dos acessos apresentaram coloração verde e apenas 10% (quatro indivíduos) apresentaram coloração do tipo verde-arroxeada. Estes resultados foram discordantes quando comparados com Pípolo et al. (2002) que, descrevendo três cultivares de acerolas utilizando descritores morfoagronômicos, observaram 100% de similaridade entre os descritores estudados para todas as cultivares selecionadas.
O teor de ácido ascórbico dos frutos maduros variou de 1.324 mg/100g de polpa no acesso ACE 010 a 2.575 mg/100 g de polpa no acesso ACE 031. Estes valores foram muito superiores aos encontrados por Brunini et al. (2004), que registraram teores de ácido ascórbico variando de cerca de 243 a 818 mg/100g de polpa, em acerolas oriundas de Aparecida do Salto-SP, porém similares aos valores encontrados por Lopes et al. (2000), que encontraram acessos com teor de ácido ascórbico de até 2.246 mg/100 g de polpa. De acordo com Bliska & Leite (1995), o teor de ácido ascórbico acima de 1.200 mg/100g de polpa é tido como um referencial mínimo para a aceitação do produto no mercado externo. Isto demonstra, portanto, o potencial existente entre os acessos de aceroleiras da Pesagro-Rio, as quais se encaixam nos padrões mínimos para exportação.
Ainda de acordo com a variabilidade morfoagronômica entre os acessos, foi verificada a formação de três grupos compostos por dois acessos cada (Tabela 01). No grupo III, encontram-se os acessos ACE 016 e ACE 046, que apresentaram copa muito ramificada, borda da corola ondulada e frutos grandes. O acesso ACE 046 apresentou teor de ácido ascórbico de 2.470 mg/100g de polpa. Para o grupo V, representado pelos acessos ACE 007 e ACE 020, foi observado conformação da copa ereta e muito ramificada, fruto imaturo de coloração verde e coloração vermelho-arroxeada quando maduro. O grupo VII, com os acessos ACE 021 e ACE 026, apresentou plantas com copa muito ramificada, bordas da corola ondulada e frutos com tamanho médio. O grupo VIII, constituído pelos acessos ACE 033 e ACE 009, apresentou frutos com teor de ácido ascórbico de 1.935 mg/100 g de polpa, bem como é caracterizado por apresentar frutos de tamanho grande.
O grupo VI, formado pelos acessos ACE 027, ACE 029 e ACE 022, caracteriza-se por reunir plantas com copa muito ramificada. Para Pípolo et al. (2002), a copa da aceroleira selecionada para ser implantada em pomar clonal foi do tipo intermediária.
Os demais grupos foram constituídos por acessos isolados, sendo eles: grupo IX, representado pelo acesso ACE 024; o grupo X, pelo acesso ACE 028; o grupo XI, que agregou o acesso ACE 023; o grupo XII, constituído pelo acesso ACE 030; o grupo XIII, formado pelo acesso ACE 025, e o grupo XIV, representado pelo acesso ACE 017, sendo observado para este acesso a coloração vermelho-arroxeada da casca do fruto maduro e fruto de tamanho grande.
Os resultados mostraram que os acessos divergentes ACE 001, ACE 014, ACE 031, ACE 038, e ACE 046 (Tabela 01, Figura 01) destacaram-se dos demais por possuírem um maior número de características de interesse agronômico, considerados de maior importância comercial, sendo indicados para propagação vegetativa e avaliação clonal, pois apresentaram alto teor de ácido ascórbico, coloração da casca avermelhada no fruto maduro e tamanho do fruto variando entre médio e grande.
Lopes et al. (2000), avaliando características físico-químicas de 112 acessos de aceroleiras, encontraram vários acessos promissores que foram recomendados para avaliação clonal, visando à utilização como variedades. Os autores encontraram frutos com teor de ácido ascórbico variando de 1.761 mg a 2.220 mg/100 g de polpa e sólidos solúveis variando de 5,8 a 10,1 ºBrix.
Pípolo et al. (2000), com o objetivo de identificar e selecionar genótipos parentais de aceroleira baseado na divergência genética multivariada em 14 genótipos, conseguiram dividi-los em três grupos, indicando sete cruzamentos mais promissores com base no teor de ácido ascórbico dos frutos: AM Mole pertencente ao grupo III, com os genótipos PR AM, Nº18, PR 17, PR 16, Eclipse, AM 22 e Dominga, todos pertencentes ao grupo I. Os autores ainda sugeriram que frutos grandes, com maior diâmetro, resultam na seleção de frutos com maior quantidade de polpa.
1-A técnica de marcadores RAPD, associados com as características morfoagronômicas, foi eficaz para investigar a diversidade entre os acessos de aceroleiras, mostrando que a população possui ampla variabilidade genética.
2-Os iniciadores OPAX 09, OPAX 14, OPAX 16 e OPAB 11 são indicados para estudos de diversidade em aceroleiras, utilizando o marcador do tipo RAPD, pois apresentaram entre seis e oito marcas polimórficas.
3-Os resultados mostraram que os acessos divergentes ACE 001, ACE 014, ACE 031 ACE 038, e ACE 046 são indicados para propagação vegetativa e avaliação clonal, pois apresentaram frutos com excelentes atributos de qualidade, isto é, alto teor de ácido ascórbico, coloração da casca do fruto maduro avermelhada e frutos grandes.
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