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A partir da descoberta de outros bioquímicos, Hans Krebs apresentou pela primeira vez o ciclo do ácido cítrico em 1937.
Hans Krebs nasceu em 25/08/1900 em Hildesheim e morreu em 22/11/1981 em Oxford.
Em 1923 em Munique, Hans Adolf Krebs gradou-se em medicina. Nesta época, iniciou seus primeiros estudos em química e física e percebeu a importância deste conhecimentos para explicar os processos biológicos. Segundo ele:
"Qualquer um que pretenda ter, mais que uma compreensão extremamente superficial da vida, em todas suas diversas manifestações, necessita da bioquímica". Hans Krebs
No Instituto Anatômico em Freiburg, Wilhelm Von Möllendorff, um líder no campo da coloração vital, deu-lhe um projeto para estudar comparativamente os efeitos de coloração de diferentes corantes sobre o tecido muscular. Adotando a abordagem "fisicalista" de coloração de Möllendorff, Krebs conclui que a intensidade e a distribuição da coloração no tecido muscular eram regulados não pelas respectivas propriedades químicas dos corantes, mas pelo grau da sua dispersibilidade e as densidades de variação das estruturas dos tecidos. Krebs escreveu-se seus resultados em um artigo de investigação.
Em janeiro de 1924 foi para Berlim para cumprir o seu exigido ano de serviço hospitalar na Terceira Clínica Médica da Universidade de Berlim. Lá, ele realizou exames preliminares no ambulatório. Incentivados a usar seu tempo livre no laboratório, ele realizou por conta própria um estudo da reação de sol de ouro que estava atualmente em uso em alguns laboratórios clínicos como um teste de diagnóstico sensível para a sífilis. Em colaboração com Annalise Wittgenstein ele começou simultaneamente experimentos com cães na passagem de substância estranha do sangue para o líquido cefalorraquidiano, um problema também ligado com sífilis, devido às dificuldades encontradas na obtenção de drogas terapêuticas. Com base na sua experiência no laboratório de Möllendorff, Krebs decidiu empregar corantes cuja presença no fluido cerebrospinal pode ser facilmente detectada colorimetricamente. Neste período, Krebs percebe que a química foi se tornando cada vez mais importante para a investigação médica, e que ele não tinha treinamento sistemático o suficiente no assunto para realizar investigações mais fundamentais do que aqueles que ele tinha feito até agora. Ele decidiu, portanto, depois de completar seu primeiro ano no hospital, se matricular em um curso de química especial oferecido no Hospital Charité nas proximidades, para os médicos. Lá, ele passou a maior parte de 1925 a aprender a realizar métodos básicos de análise qualitativa e quantitativa.
Em dezembro do mesmo ano Krebs se tornou professor auxiliar de Otto Warburg, o qual estava dando aulas de bioquímica. Warburg procurava um jovem cientista para colocar em prática suas ideias e teorias, assim Bruno Mendel indicou Krebs. Lá, ele aprendeu métodos manométricos que Warburg tinha inventado a fim de medir as taxas de respiração e glicólise das células cancerosas e compará-los com as tarifas em tecidos normais. Em um de seus primeiros projetos atribuídos, Krebs prorrogou as medidas que Warburg tinha feito em tecido de tumor de rato para os tecidos obtidos a partir de pacientes humanos. O principal interesse de Warburg quando Krebs se juntou ao laboratório, foi descobrir a natureza de enzimas e coenzimas que coordenavam a respiração celular e a diferenças entre tecidos normais e tecidos tumorais.
Depois que Krebs se tornou hábil em técnicas manométricas viu que o método podia ser aplicado com grande vantagem para estudar o metabolismo intermediário. A partir de alguns de seus professores na faculdade de medicina, e particularmente nas palestras de Franz Knoop em Freiburg, ele tinha ouvido falar que pouco era conhecido da série de reações entre os alimentos que entram no corpo e seus produtos de decomposição final, e que deve ser um objetivo central da bioquímica para estabelecer as sequências ininterruptas de equações químicas que deve conectá-los. Quando ele foi ousado o suficiente para sugerir a Warburg que ele poderia gostar de aplicar os métodos manométricos a estes problemas, Warburg disse-lhe que tais experimentos seriam de nenhum interesse para ele, e que não havia espaço suficiente em seu laboratório para qualquer um para trabalhar em outros do que seus próprios problemas. Krebs não teve escolha senão se conformar, a idéia, no entanto, apareceu tão atraente para ele que ele manteve firmemente em mente como uma meta que ele iria prosseguir quando ele eventualmente tornar-se livre para definir o seu próprio percurso investigativo. Em 1929, Warburg disse Krebs que ele não poderia permanecer como assistente de pesquisa após 31 de Março de 1930.
Após uma série de investigações infrutíferas, ele obteve um cargo no hospital municipal de Altona, perto de Hamburgo, no Departamento de Medicina, dirigido por Leo Lichtwitz, um excelente médico com um interesse em doenças metabólicas. A fim de obter o apoio da Warburg de uma subvenção para a compra manómetros para que ele pudesse fazer a pesquisa, ele foi obrigado a empreender uma investigação de proteólise em células tumorais para Warburg. O projeto não muito interessá-lo. Enquanto obedientemente sua realização, ele procurou por aberturas que permitiam a ele para começar um programa de sua própria investigação. Sua primeira idéia bem sucedida veio da recente descoberta de Einar Lundsgaard que os músculos envenenados com iodoacetato poderia continuar a contrair para um curto período de tempo, mesmo que eles não poderiam produzir ácido lático. Este achado perturbou o ponto de vista de corrente dominante, formulada por Otto Meyerhof, que a formação de ácido láctico foi diretamente relacionada com a contração muscular.
Estendendo resultados de Lunds Gaard para outros tecidos animais, Krebs foi capaz de mostrar que o ácido láctico adicionado a fatias envenenadas com iodoacetato restaurava a sua respiração. Em março de 1931, ele publicou seus resultados em um curto espaço de papel que marcou sua emergência como um investigador independente e sua entrada no campo do metabolismo de carboidratos intermediário.
Não muito tempo depois de chegar à Altona, Krebs já tinha feito arranjos para ir para Freiburg em abril de 1931, para se tornar um assistente para Siegfried Thannhauser, um especialista em doenças metabólicas no Departamento de Medicina. Durante seus primeiros três meses lá, ele continuou a linha de investigação do metabolismo de carboidratos que ele tinha começado em Altona, mas em julho ele embarcou em um novo e importante problema: para determinar como a ureia era sintetizada no organismo animal. O ciclo da ornitina foi rapidamente reconhecido como uma grande descoberta, ganhando Krebs o louvor de bioquímicos líderes na Alemanha e em outros lugares. Sua realização levou à sua nomeação, em dezembro de 1932 como um Privatdozent na Universidade de Freiburg. Isso levou Warburg a reconhecer a capacidade de seu ex-assistente, e ele deu à Krebs uma autoconfiança que ele nunca perdeu.
Tendo tomado conhecimento da admiração em que o líder da escola de bioquímica de Cambridge, Frederick Gowland Hopkins, tinha devido seu trabalho na síntese de uréia, Krebs escreveu-lhe perguntando se ele poderia trabalhar no laboratório de Cambridge. Em Cambridge, Krebs perseguiu por mais seis meses as questões relativas ao metabolismo de carboidratos, ácidos graxos, e substâncias relacionadas que ele tinha começado em Freiburg. Sentindo que estava atolado, ele abandonou abruptamente esta linha de investigação em dezembro e voltou-se para outras questões metabólicas.
Durante o verão de 1935, Krebs foi convidado para se candidatar a uma posição como professor do Departamento de Farmacologia da Universidade de Sheffield, com o entendimento de que sua pesquisa e ensino seriam em bioquímica. Ele o fez, e assumiu o seu posto em outubro. Nos meses antes de sair para Sheffield, Krebs tinha empreendido, com dois estudantes, um estudo mais aprofundado da síntese de ácido úrico nas aves. Em Sheffield ele continuou a trabalhar sobre este problema, mantendo-se em contacto estreito com os alunos, que permaneceram em Cambridge. Até o final do ano, no entanto, ele tinha feito pouco progresso nesta direção, e ele virou-se novamente para outros problemas.
No início de 1936, testaram uma primeira hipótese: ácido pirúvico que reage com amônia e um segundo ácido cetônico para formar um ácido acetilamino, que em seguida se decompõe para originar o aminoácido correspondente ao segundo ácido cetônico. Krebs reconheceu que os dados poderiam igualmente caber uma reação de oxidoredução entre os dois ácidos cetônicos para que a amônia era desnecessário.
Este resultado levou-o a estudar as reações anaeróbias de piruvato e outros ácidos cetônicos como conexões potenciais entre a recém-criada via Embden-Meyerhof da glicólise e da discriminação adicional do ciclo oxidativo de carboidratos. No verão de 1936, ele estava convencido de que ele tinha suficientemente demonstrado a existência de uma rota de tais reações e submeteu seus trabalhos a Nature com um documento preliminar intitulado Metabolismo intermediário de carboidratos, na qual ele afirma ter encontrado algumas novas reações químicas em células que representam passos na quebra de carboidratos vivo. Ele apresentou uma sequência de três reações de dismutação que ele acreditava ser dos passos principais da oxidação do ácido pirúvico.
Enquanto isso, em Szeged, Hungria, Albert Szent-Györgyi estava investigando a respiração no tecido isolado com métodos semelhantes aos utilizados Krebs. Entre 1934 e 1936 Szent-Gyorgyi e seus colegas mostraram que o ácido fumárico adicionado em quantidades catalíticas para músculo do peito de pomba pode sustentar a sua respiração a uma taxa normal. Szent-Györgyi propôs um esquema cíclico em que succinato foi oxidado por meio de fumarato a oxaloacetato, sendo este último, por sua vez convertidos diretamente para succinato pelo que chamou de 'overreduction.'
Krebs estava insatisfeito com a ideia do 'overreduction' de oxaloacetato. E durante o verão e o outono de 1936, Krebs estendeu suas investigações de reações de oxidação-redução acopladas a incluir reações de desidrogenação do ácido fumárico, oxaloacético e málico. Neste trabalho, ele buscou combinar a concepção de reações intermediários do metabolismo dos carboidratos que tinha recentemente apresentados na Nature.
De tempos em tempos Krebs testava experimentalmente possíveis esquemas de reação, mas ele não alcançou resultados promissores até o outono de 1936. Em seguida, ele e seu primeiro aluno de pós-graduação em Sheffield, William Arthur Johnson, obtiveram evidências experimentais de que o ácido pirúvico e oxaloacético somados dava origem a quantidades significativas de ácido cítrico. Acreditando que ele tinha encontrado o caminho pelo qual o ácido cítrico é formado.
Em outubro e novembro de 1936, ele discutiu em várias palestras públicas as várias reações de dismutação que ele havia encontrado na degradação oxidativa de hidratos de carbono, mas ele classificou o esquema apresentado por ele como provisório e incompleto. Considerou que tinha demonstrado ser o ácido cítrico, um intermediário na quebra de ácido pirúvico e ácido málico, 'mas enfatizou' que parecia ser apenas uma reação secundária.
No final de abril, época em que ele provavelmente viu que esta linha de investigação não estava levando em direção a conclusões mais amplas, viu na última edição da Biochemische Zeitschrift um papel preliminar por Carl Martius e Franz Knoop propor uma nova via para a decomposição fisiológica de cítrico ácido:
Ácido cítrico → cis-ácido aconítico → ácido → oxaloacético ácido → ácido cetoglutárico-α isocítrico.
Quando Krebs leu este papel, ele provavelmente percebeu de imediato que essas reações podem fornecer a ligação crucial entre a decomposição do ácido cítrico e as principais vias do metabolismo oxidativo. Com o auxílio de Johnson, ele rapidamente confirmou que, na presença de agentes de bloqueio adequados, o ácido cítrico dá origem a quantidades substanciais de α-cetoglutárico e ácido succínico. Por, em seguida, ele provavelmente tinha chegado à concepção geral de que existe um caminho cíclico através do qual o ácido succínico formados a partir de ácido cítrico dá origem ao ácido málico e oxaloacético, que regenera o ácido cítrico, por meio da reação de dismutação tinha encontrado no tecido muscular pombo durante o outono anterior. Logo depois, no entanto, as experiências de Johnson mostraram que o ácido oxaloacético sozinho produzia ácido cítrico anaerobicamente mais rapidamente do que fez ácido oxaloacético acrescido de piruvato, então Krebs desistiu da idéia de que a dismutação especificamente identificado foi envolvido na reação sintética que produziram ácido cítrico.
Em seguida, ele provavelmente tinha chegado à concepção geral de que existe um caminho cíclico através do qual o ácido succínico formado a partir de ácido cítrico dá origem ao ácido málico e oxaloacético, que regenera o ácido cítrico. Ele assumiu depois que o ácido oxaloacético reage com um produto desconhecido do metabolismo de carboidratos que ele rotuladas provisoriamente como "triose".
Cerca de seis semanas após encontrar o artigo de Martius e Knoop, Krebs tinha acumulado o que ele considerou evidências convincentes para a existência de um "ciclo do ácido cítrico" que constituiu a via "preferencial", através do qual o carboidrato pode ser oxidado em tecidos animais. "Até 10 de junho, ele tinha enviado para a Nature um curto artigo "O Papel do ácido cítrico no metabolismo intermediário nos tecidos animais ", enquanto ele continuou a recolher dados de apoio. Quando o editor de Nature informou-lhe que, por causa de um atraso, o documento não seria publicado sem um atraso substancial, Krebs escreveu uma versão mais longa do papel e enviá-lo para Enzymologia, um jornal fundado recentemente que era menos prestígio do que aqueles em que ele normalmente pubslihed, mas em que ele sabia que seu papel seria aceito imediatamente e aparecem rapidamente. Ele estava impaciente porque ele sabia que tinha chegado a uma conclusão de fundamental importância no metabolismo intermediário. O ciclo de ácido cítrico que ele apresentou, quando combinada com a via glicolítica Embden-Meyerhof, ativado pela primeira vez uma visão coerente das principais etapas do processo que foi considerado como a principal fonte de energia para as atividades vitais dos organismos vivos.
Em 1938, Krebs recebeu o título de professor em bioquímica, e montou recém-criado Departamento de Bioquímica em Sheffield. A Fundação Rockefeller, que tinha até então apoiado sua pesquisa com subsídios anuais de investigação, começou a financiar a atividade de seu departamento em doações de cinco anos, que foram renovados regularmente. O laboratório em Sheffield começou a atrair estudantes e investigadores que visitavam a Inglaterra e no exterior. Krebs e seus associados continuaram a investigar os temas que ele havia anteriormente exercido. Em 1940, ele havia substancialmente reforçado as evidências para o ciclo de ácido cítrico e refutou algumas críticas que haviam sido feitas. Os primeiros estudos isotópicos em outros laboratórios, em 1941, confirmaram as linhas gerais da teoria, mas indicavam que o ácido cítrico em si estava fora da via principal. consequentemente, o ciclo foi rebatizado de "ciclo de ácido tricarboxylic," embora ele já foi referido às vezes como o "ciclo de Krebs".
Em 1953, a importância primordial de que o ciclo do ácido cítrico tinham atingido em bioquímica foi reconhecido na atribuição do Prémio Nobel para Krebs e Fritz Lipmann, cuja descoberta da coenzima-A tinha especificado os detalhes do passo crucial sintético no ciclo. Logo depois ,Krebs foi convidado para se tornar o sucessor Rudolph Peters como professor de bioquímica na Universidade de Oxford, e para assumir a responsabilidade pelo grande Departamento de Bioquímica. Depois de receber garantias de que ele poderia trazer a sua unidade de investigação metabólica junto com ele, ele aceitou.
Até o momento em que Krebs chegou a Oxford, isótopos radioativos, espectrofotometria, cromatografia e outros métodos novos tinham facilitado a investigação dos passos intermediários em vias metabólicas. Muitos laboratórios tinham feito contribuições e a maioria das principais vias haviam sido identificadas e ligadas. Numerosos detalhes ainda precisam ser elucidado, e a equipe de Krebs continuou a desempenhar um papel significativo nesse trabalho. Ele voltou sua atenção cada vez mais, no entanto, para a questão de como as taxas e direção das reações são controladas para atender às diferentes exigências do organismo. Em 1957, ele esboçou sua abordagem geral para o problema.
Krebs chamou a atenção para a importância das relações entre as formas de catalisadores reduzidas e oxidadas, tais como, os nucleótidos de piridina, que estão ligados às vias metabólicas como receptores ou doadores de hidrogênio, e a taxa de ATP e ADP e fosfato inorgânico. Estes sistemas de controle operado sobre os princípios de mecanismos de feedback. Nas próximas duas décadas Krebs dirigiu o trabalho de seu grupo em direção a especificação mais detalhada dessas ideias gerais. Em 1963, ele explicou como a formação de hidratos de carbono a partir de fontes não-carboidratos, um processo conhecido como gliconeogênese. Para passos críticos na via da gliconeogênese conversão de difosfato de frutose em frutose-6-fosfato, e a conversão de piruvato em fosfopiruvato foram identificados como as reações "pacemaker".
A primeira investigação principal sobre o metabolismo intermediário de oxidação foi de Thunberg, que examinou sistematicamente e arbitárias substâncias orgânicas em tecidos animais isolados. Entre 1906 e 1920, ele testou a oxidação de mais de 60 substâncias orgânicas, principalmente no tecido muscular. Ele descobriu a oxidação rápida dos sais de muitos ácidos, tais como lactato, succinato, fumarato, citrato, malato e glutamato. Resultados do Thunberg foram confirmados e estendidos por Batelli e Stern e investigados mais tarde. Mas eles não conseguiram ligar o processo oxidativo do músculo com a oxidação dos carboidratos. Avanços nos estudos ocorreram em 1935 com Szent-Györgyi. Depois em 1937 em Sheffield foi descoberto que o citrato pode atuar de forma catalítica da mesma forma que o succinato. Um valaiosa contribuição foi feita em março de 1937 por Martius e Knoop que elucidou o destino do citrato quando submetido a oxidação em material biológico. Sabia-se que o citrato podia ser oxidado em plantas, animais, e microrganismos, mas as etapas intermediárias estavam obscuras até Martius e Knoop descobrirem o α-cetoglutarato como um produto de oxidação de citrato. Eles mostraram esta reação em extratos de fígado e de sementes de pepino e sugeriram que o cis-aconitato e isocitrato eram intermediários da rota.
Em junho de 1937 outros avanços foram feitos em Sheffield. Em primeiro lugar, a reação que Martius Knoop tinha demonstrado no fígado foi encontrada a ocorrer a uma taxa rápida em músculos e outros tecidos. A taxa foi considerada suficiente para justificar o pressuposto que a reação constitui um componente principal do aparelho respiratório processo do tecido. A formação de cetoglutarato de citrato pode ser demonstrado por dois processos, quer pela adição de arsenito ou pela aumento da concentração de citrato para um nível elevado.
De grande importância foi outro nova observação: citrato não só foi discriminado em uma taxa rápida, mas foi também facilmente formado no músculo e em outros tecidos que o oxaloacetato foi adicionado. Isto poderia ser explicado pelo princípio de que alguns oxaloacetato foi dividido em piruvato ou etilo, e que o formação de citrato foi o resultado de uma combinação entre o restante oxaloacetato, por um lado, e piruvato de etilo ou no outro. A descoberta da síntese de citrato de oxaloacetato e uma substância que podia ser derivado de hidrato de carbono, tal como piruvato de etilo ou, tornou possível formular um regime completo de oxidação do hidrato de carbono.
Por uma sequência de reações em que aconitate cis-isocitrato, α-cetoglutárico, ácido succínico, fumárico, málico, oxaloacético são intermediários, um equivalente de ácido acético é oxidado a ácido oxaloacético requerido para a reação de condensação é regenerado. Uma vez que a formulação original do ciclo em 1937, três intermediários adicionais foram identificadas. Em 1948 o ácido oxalosuccínico como um intermediário foi postulado por Martius e Knoop. Eles demonstraram a presença de uma descarboxilase específica do oxalosuccinate para converter α-cetoglutarato. Uma muito grande conquista foi a identificação do derivado de piruvato que condensa com o oxaloacetato para formar o citrato. Graças aos trabalhos de Lipmann, Stem e Ochoa e Lynen descobriu a presença da acetil coenzima A. Finalmente, experimentos realizados por Ochoa e Green mostraram que a coenzima A também particpava da conversão do α-cetoglutarato para succinato e que o succinil coenzima A é um estádio intermediário.
Dos 20 aminoácidos que são comumente encontrados como componentes proteicos, três – ácido glutâmico, ácido aspártico, alanina são derivados de formas que são intermediárias no ciclo do ácido cítrico. Cinco outras – os aminoácidos histidina, arginina, citrulina, prolina, hidroxiprolina – são conhecidos para formar o ácido glutâmico no corpo do animal e, por conseguinte, que pode entrar no ciclo do ácido cítrico via ácido α-cetoglutárico. Mais cinco aminoácidos – os três leucina, tirosina, fenilalanina – rendimento de acetil-coenzima A e ácido málico; os 13 aminoácidos listados constituem uma grande proporção do proteínas comuns, e.g. mais de 75% no caso de caseína. Desde 1943, tornou-se evidente que o ciclo do ácido cítrico também entra em nas fases posteriores da oxidação de ácidos graxos. Acetil-coenzima A é a forma pela que todos os átomos de carbono dos ácidos gordos entram no ciclo. As reações do ciclo podem fornecer um importante intermediário para um número de sínteses, por exemplo, α-cetoglutárico, que é um precursor do ácido glutâmico e outros ácidos aminados, bem como do porfirinas necessário para a síntese dos citocromos e o pigmentos do sangue.