Os lotes de HES provaram efi reprodutívelcácia em ensaios funcionais e na composição das proteínas; Além disso, quando foram analisados ​​os sobrenadantes de cada semana sucessiva de cultura, até um total de 4 semanas, os perfis de proteínas foram encontrados para ser muito semelhante (Figura 3). Quando a concentração de HES é medida pelo ensaio de Bradford (ver 5.5), o total proteína é geralmente cerca de 1 mg / mL (Figura 4).
Um método alternativo de se concentrar HES é com um concentrador centrífugo (por exemplo, 3-kDa membrana de corte Vivaspin), em que as amostras são centrifugadas a até 4.000 g numa centrifugadora de rotor basculante para fora, remoção de sais do tampão e os componentes de baixo peso molecular. Concentração centrífuga é o mais adequado para processamento de volumes pequenos (1-10 ml) e são limitados a um máximo factor de concentração de aproximadamente 30x.
Ao coletar HES, prevenção da contaminação é crítica. Para evitar a contaminação com moléculas do hospedeiro, descartamos HES-containing meios de cultura a partir do primeiro de 24 horas após a colheita verme adulto a partir do intestino mouse. Nós também quantificar o nível de contaminação por LPS em cada lote de HES com um ensaio cromogénico de LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS e níveis abaixo desta são consideradas insignificantes 23. Em nossas mãos, a maioria dos lotes de HES são significativamente abaixo deste limite, a concentração média de LPS em HES sendo 0,23 U / g (Figura 5). Os efeitos de LPS em modelos in vivo de patologia (por exemplo, a supressão de respostas asmáticas) requer, pelo menos, 10 ng de LPS 23. Daí a administração in vivo de 5 ug HES de um lote com 100 pg LPS / ug HES vai incluir 500 LPS pg, bem abaixo da concentração eficaz onde LPS se torna um problema.