Bolsa 18/05930-0 - Glioblastoma, Neoplasias - BV FAPESP
Identificação e caracterização de microRNAs envolvidos com a inibição da via de sinalização NF-kB pela ação do Glicirrizinato Dipotássio em linhagens celulares de glioblastoma multiforme
Processo: 18/05930-0
Assunto(s): Glioblastoma Neoplasias MicroRNAs Glicirrizinato dipotássico Transdução de sinais
O glioblastoma multiforme (GBM) representa 15-20% dos tumores neurológicos sendo considerado o mais agressivo. A heterogeneidade biológica e a resistência a quimioterápicos são os maiores obstáculos para o tratamento efetivo do GBM. Vários genes e vias de sinalização têm sido apontados como responsáveis pelo fenótipo agressivo desse tumor. A via NF-ºB encontra-se continuamente ativa nas células tumorais do GBM regulando o aumento da expressão de genes anti-apoptóticos e ativação de fatores de sobrevida, adesão e invasão celulares. Foi comprovado que o ácido glicirrízico (AG) causa redução do processo inflamatório por suprir a expressão da proteína nuclear NF-ºB p65 e aumentar a expressão da proteína supressora tumoral p53 e das proteínas pró-apoptóticas caspase-9 e -3 clivadas in vitro e in vivo. O glicirrizinato dipotássio (DPG) é um subproduto do AG e apresenta também propriedades anti-inflamatórias, porém sem os efeitos colaterais observados com a administração oral de AG. Estudos prévios em nosso laboratório, com as linhagens celulares de GBM, U87MG e T98G, demostraram que o DPG apresenta efeito citotóxico e antiproliferativo. Também foi verificado que o DPG induziu apoptose nas linhagens celulares estudadas pela fragmentação do DNA e da expressão da proteína pró-apoptótica caspase-3 clivada. Além disso, o DPG inibiu a via NF-ºB através da modulação dos microRNAs (miRs) mir-16 e miR-146a, os quais inibiram a expressão de seus genes alvos IRAK2 e TRAF6, respectivamente. Conforme o exposto, o objetivo primário deste estudo será avaliar o efeito inibitório do DPG na via NF-ºB pela modulação de miRs. Para a identificação de miRs será realizado uma análise global de 96 miRs previamente conhecidos como reguladores de genes envolvidos com a via NF-ºB em amostras de RNA coletados a partir da linhagem celular U87MG, tratada ou não com DPG, pelo método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) utilizando o TaqMan MicroRNA Array Plate. Em seguida, será realizada uma seleção dos miRs relevantes na linhagem U87MG tratada com DPG em comparação com a amostra não exposta ao DPG. Após a seleção de miRs candidatos como possíveis responsáveis pela inibição de NF-ºB, a expressão dos mesmos será validada por meio da qPCR em amostras de RNA a partir das linhagens celulares de GBM, U87MG, T98G, U138MG e U251 expostas à ação do DPG. Células não tratadas serão utilizadas como controles. Além disso, será avaliado o efeito que o DPG exerce no ciclo celular e morte celular por citometria de fluxo, ensaio do TUNEL e western blotting para caspase-9 e PARP. Estudos funcionais com mimics e anti-miRs também serão realizados e poderão auxiliar no entendimento da inibição dos miRs selecionados pelo DPG. (AU)