Em suas pesquisas, muitas vezes é necessário replicar as condições de execução que você encontra em protocolos publicados. Ao revisar esses protocolos, certifique-se de que as instruções oferecem informações completas sobre a execução, incluindo o nome do rotor ou o raio máximo, RPM , RCF e o tempo de execução.
O uso de cálculos centrífugos
Ao revisar os protocolos publicados, certifique-se de que as instruções oferecem informações completas sobre a execução, incluindo o nome do rotor ou o raio máximo, RPM ou RCF e tempo de execução. Por exemplo, a menos que um rotor também seja especificado, ou seu raio máximo seja dado, não há nenhuma maneira de saber qual RCF é necessária para alcançar essa separação. Um rotor tal como o JS-5.2 com um rmáx de 226 mm gera 4.050 x g. Esta diferença de 500 x g parece pequena, mas é grande o suficiente para afetar os resultados de certas separações se for desconsiderada. A preparação de componentes sanguíneos ou o passo de peletização especificado pelos kits de radioimunoensaio (RIA) são exemplos de separações que requerem uma atenção cuidadosa às condições de centrifugação.
Muitos adaptadores projetados para transportar uma série de pequenos tubos têm fundos, com 10 mm-15 mm ou mais de espessura. A maioria das separações não será afetada por esta pequena redução no rmáx efetivo. Mas se for necessário um cálculo mais exato do RCF ao usar tais adaptadores, você terá que subtrair a espessura da parte inferior do adaptador do rmáx do rotor para obter o rmáx efetivo para essa combinação de adaptador de rotor.
Isto não quer dizer que uma execução feita em um rotor não possa ser duplicada em um rotor com um rmáx diferente. Os mesmos resultados podem ser alcançados, mas uma mudança na velocidade do rotor (ou no tempo de execução) deve ser feita para compensar a diferença em rmáx. Use o nomograma abaixo para seleção de velocidade. Seguindo estas instruções, você pode estimar o RCF e as velocidades para rotores de vários raios.
Você também pode calcular a velocidade adequada para usar por meio da equação RCF abaixo. Digamos que você queira seguir um procedimento escrito para um rotor com um rmáx de 250 mm que requisite um RCF de 3.430 x g. Você quer duplicar estas condições no rotor JS-5.2 Beckman Coulter que tem um rmáx de 226 mm. Neste caso, você precisa transpor a equação para resolver a velocidade em RPM , então RCF = 1.12r (RPM/1.000)2 torna-se
Assim, o rotor JS-5.2 produzirá um RCF de 3.400 x g se executado a cerca de 3.681 RPM. Se as direções originais tivessem especificado a velocidade e o raio do rotor a ser usado, em vez de o RCF, você primeiro teria que encontrar o RCF que a combinação gerou, por meio do nomograma para a Tabela de seleção de velocidade acima ou esta equação:
Às vezes, pode ser melhor mudar o tempo em que as amostras são centrifugadas do que mudar a força centrífuga. Você pode querer duplicar um procedimento que exige 10 minutos de centrifugação a 3.000 g. Você pode usar um rotor JR-3.2 que atinja um RCF máximo de 2.300 x g? Sim, mas você terá que executar as amostras por um pouco mais de tempo. O tempo requerido pode ser encontrado com esta equação:
t1 = tempo de execução necessário para o rotor JR-3.2
t2 = tempo de execução especificado no procedimento
RCF1 = RCF do rotor JR-3.2 à velocidade máxima
RCF2 = RCF especificado no procedimento
Assim, no nosso exemplo'
As diretrizes dadas para os tempos de centrifugação correspondem normalmente aos tempos a serem definidos no controle de tempo da centrífuga. Esta configuração inclui o tempo para o rotor acelerar e o tempo na velocidade de operação, mas não o tempo de desaceleração. O último depende do peso do rotor, incluindo sua carga, do tipo de sistema de freio e da configuração de freio selecionada pelo operador. Se for utilizada uma configuração de freio máximo, um rotor totalmente carregado leva entre 1 e 3 minutos para desacelerar. A sedimentação das partículas na amostra continua durante a desaceleração, é claro, mas a taxa diminui à medida que o rotor desacelera. Os tempos de desaceleração mínimos podem ser obtidos através da utilização das configurações de freio máximo. Contudo, a frenagem máxima na fase final da desaceleração do rotor pode ser muito brusca quando estão sendo usados frascos de diâmetro grande ou bolsas de sangue; o resultado pode ser alguma agitação indesejável e ressuspensão do material sedimentado. A presença deste material ressuspenso pode facilmente ser confundida com uma separação deficiente. Uma palavra de cautela: antes de alterar as condições de centrifugação, certifique-se de que sua amostra específica não será prejudicada por peletização mais dura ou por tempos de centrifugação mais prolongados. Pequenas mudanças normalmente não causam problemas. No entanto, algumas amostras biológicas se deterioram se centrifugadas por muito tempo, especialmente sem refrigeração. E certos ensaios, que são vendidos na forma de kits, podem ser sensíveis ao tempo. Em caso de dúvida, siga as instruções originais, tanto quanto possível.