Onconews - Estudo brasileiro compara protocolos para remoção de melanina do DNA genômico
Estudo brasileiro compara protocolos para remoção de melanina do DNA genômico
Estudo realizado por pesquisadores do Hospital de Amor (Hospital de Câncer de Barretos) comparou seis métodos diferentes de remoção de melanina do DNA genômico. O objetivo é remover a melanina antes de realizar os métodos de PCR, o que impacta diretamente as aplicações de pesquisa e os testes de diagnóstico molecular necessários para terapias-alvo. Publicado no periódico Histology & Histopathology, o trabalho tem como autor sênior o cirurgião oncológico Vinicius de Lima Vazquez (foto).
A melanina é produzida pelos melanócitos e protege contra danos no DNA pela luz ultravioleta. Infelizmente, a proteína melanina presente nas células tumorais do melanoma é frequentemente co-purificada durante a extração do DNA, e essa contaminação pode inibir os métodos de PCR subsequentes e impactar a pesquisa e os testes de diagnóstico molecular necessários para terapias-alvo. Atualmente, não existem protocolos de purificação descritos que removam eficientemente a melanina do DNA genômico.
"Este trabalho surgiu de um problema real. A amplificação de DNA de amostras de melanoma, principalmente de parafina, na presença de grande quantidade de melanina apresenta altos índices de falha. Achar uma solução era crucial, pois o sequenciamento de DNA de melanomas faz parte da prática diária para a escolha terapêutica dos pacientes", explica Vazquez.
Neste estudo, foram comparados seis diferentes métodos de remoção de melanina do DNA genômico: eletroforese em gel de agarose, 1mg de Chelex®-100, Chelex®-100 5%, centrifugação, kit de remoção de inibidor de PCR OneStep™ e centrifugação mais kit de remoção de inibidor de PCR OneStep™. Cada comparação foi feita utilizando 16 amostras de linha celular frescas fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE).
Todas as amostras foram inicialmente testadas usando a reação de PCR multiplex para o gene GAPDH, que gera produtos amplificados de diferentes tamanhos: 100, 200, 300 e 400 pares de bases, que poderiam ser inibidos pela adição de melanina exógena.
Seis protocolos de purificação foram aplicados, e todas as amostras que amplificaram pelo menos um fragmento de GAPDH foram sequenciadas para analisar a presença da mutação BRAFV600E. As eficiências de amplificação diminuíram para fragmentos maiores em todos os métodos.
"Nossas comparações mostraram que a centrifugação combinada com kit de remoção de inibidor de PCR OneStep™ foi superior a todos os outros métodos de sequenciamento BRAF com 100% (100pb), 75% (200pb), 50% (300pb) e 31,3% (400pb) de eficiência de amplificação para os diferentes tamanhos de amplicons", afirmam os autores.
Os pesquisadores concluíram que o método de extração de DNA genômico é altamente eficiente para uma PCR bem-sucedida quando amostras de tumores estão contaminadas com melanina. "O sucesso desta técnica irá possibilitar um melhor diagnóstico e consequentemente melhor tratamento para pacientes já no presente. Isso para nós é motivo de grande satisfação", conclui o especialista.
Referência: Comparison of protocols for removal of melanin from genomic DNA to optimize PCR amplification of DNA purified from highly pigmented lesions - Anna Luiza Silva Almeida Vicente, Raquel Alves Bianchini, Ana Carolina Laus, Graziela Macedo, Rui Manuel Reis and Vinicius de Lima Vazquez - DOI: 10.14670/HH-18-112