Na busca ao melhoramento genético de um rebanho, a inseminação artificial (IA) apresenta-se como a primeira biotécnica a ser implantada, em virtude do seu menor investimento e da simplicidade, quando comparada às demais biotecnologias. Todavia, sua eficiência envolve vários fatores, sendo a preservação da viabilidade das células espermáticas crucial para o sucesso de sua aplicação.
O simples fracionamento de um ejaculado amplia o aproveitamento do germoplasma masculino (Mies Filho, 1982), e a adição de meios diluentes propicia sua otimização. As possibilidades de uso do sêmen ovino aumentam consideravelmente com a técnica e a solução preservadora empregada durante a sua manipulação. Diversas formulações são propostas para a composição do diluente, com a finalidade de conservação, por longos períodos, da capacidade fecundante de células espermáticas armazenadas in vitro (Salamon e Maxwell, 1995).
O frio, na faixa dos 5 a 0°C, é um importante agente conservador, por promover a redução do metabolismo celular para próximo ao estádio de quiescência, propiciando a estocagem prolongada e favorecendo o transporte do sêmen (Palhão et al., 2006). Todavia, esse mesmo agente também é promotor de lesões nas membranas espermáticas, tornando imprescindível o controle da diminuição de temperatura (Evans e Maxwell, 1990) e o uso de substância lipoproteica que ofereça proteção contra o choque térmico (Salamon e Maxwell, 2000). Na refrigeração do sêmen, utiliza-se a gema de ovo e o leite como fonte lipoproteica, elementos necessários à sobrevivência dos espermatozoides (Evans e Maxwell, 1990; Vishwanath e Shannon, 2000), existindo várias indicações de proporções na composição do meio diluente (Maxwell e Salamon, 1993).
As propriedades básicas de um bom diluente são: pH e osmolaridade próximos ao fisiológico, capacidade de prevenir a capacitação espermática precoce e de proteger de eventuais crioinjúrias (Salamon e Maxwell, 1995). A biossegurança também é fundamental durante o processamento do sêmen, refletindo diretamente na eficiência da aplicação dessa biotecnologia, o que demanda a formulação de meios diluentes estéreis e de boa qualidade (Machado e Vieira, 2001).
Os diluentes comerciais, além de contribuírem para a maior praticidade do emprego da IA, apresentam o controle dos componentes durante o processo de fabricação, constituindo uma garantia quanto ao período de conservação das características e da segurança do produto. Desse modo, os objetivos deste estudo foram avaliar a viabilidade in vitro de células espermáticas após a adição de três diluentes comerciais e compará-los com o diluente tradicional Tris-gema, utilizados no processo de refrigeração do sêmen ovino em até 48h de armazenamento.
Como doadores de sêmen, foram utilizados três carneiros da raça Dorper, com idades entre um e três anos, comprovadamente férteis, mantidos em regime de manejo intensivo com arraçoamento de feno Tyfton, suplementados com 500g de concentrado/animal/dia, além de sal mineral e água ad libitum. Cada animal foi submetido a colheitas diárias de sêmen com vagina artificial, utilizando como manequim fêmea em estro, a intervalo de três dias, em três blocos de repetições, totalizando 27 ejaculados. Os ejaculados que apresentaram o volume, a cor e o aspecto dentro dos padrões fisiológicos para a espécie (Fonseca et al., 1992) foram imediatamente colocados em banho-maria a 30ºC. Uma alíquota de sêmen foi submetida à avaliação entre lâmina e lamínula pré-aquecidas a 37°C, em microscópio com platina aquecedora na mesma temperatura. Foram aprovadas as amostras que apresentaram o valor mínimo: de 3 (0-5) para turbilhonamento, 70,0% para motilidade individual progressiva (MIP) e 3 (0-5) para vigor espermático (Fonseca et al., 1992).
Formou-se um pool com três ejaculados de cada animal, e foram repetidas as avaliações macro e microscópica como anteriormente descritas. Também foram obtidas, desse pool, alíquotas para estimar o pH (Merck - PAP Indic pH 0-14 - Merck- Alemanha) do sêmen e avaliar a concentração espermática e a integridade do DNA (Evenson et al., 1999) e do acrossoma (Roth et al., 1998). Em seguida, dividiu-se o pool em cinco amostras iguais, que foram diluídas na proporção 1:3 (sêmen:diluente) para constituir os seguintes tratamentos: Equimix® (Nutricell - Nutrientes Celulares Ltda.) (DI), Laiciphos Green Ovine® ( IMV - IPV Brasil Ltda.) (DII), FR-4® ( Nutricell - Nutrientes Celulares Ltda)3 (DIII), Equimix-Gema (Equimix adicionado de 20% de gema de ovo) (DIV) e Tris-Gema (Evans e Maxwell, 1990) - controle - DV). Foram utilizadas para os grupos DII, DIV e DV partes iguais de um homogeneizado de gema de ovo fresca, de no máximo três dias. A aferição do pH dos cinco meios foi feita com pHmetro digital (Ph100 da Phtek®), antes de se proceder às diluições.