Fixação – tem por finalidade conservar os tecidos com o aspecto mais próximo possível daquele do material vivo. O fixador mais frequentemente utilizado é o Formol a 10%. O órgão é submerso em formol e, dependendo da densidade do tecido, do seu tamanho e da temperatura ambiente, a fixação pode ser mais rápida ou mais lenta. Após a fixação examinamos a olho nu o material e retiramos os fragmentos a serem processados e examinados microscopicamente. Os fragmentos são então acondicionados em pequenas caixas perfuradas de plástico (cassetes) com a identificação do material tampadas e entregues ao técnico para processamento.
Processamento em parafina – tem por finalidade retirar a água do tecido e substituí-la por parafina, o que torna o tecido mais firme e portanto passível de ser cortado em fatias delgadas (5 m= 5milésimos de milimetro). Isto é feito pela imersão dos cassetesem banhos sucessivos de álcool (que retira a água mas não se mistura com parafina), de xilol (que se mistura tanto com o álcool quanto com a parafina) e finalmente em parafina aquecida (entre 55 e 60o C). Com isto toda a água do tecido é retirada e substituída por parafina.
Inclusão – o tecido parafinizado é incluído em um pequeno bloco de parafina, com a sua identificação e que é submetido à microtomia. Fotografar bloco de parafina para colocar aqui.
Microtomia – consiste em cortar o bloco de parafina em fatias muito delgadas. O micrótomo tem um componente em que o bloco é mantido firmemente preso e alinhado (braço), outro mecanismo que movimenta o braço no qual o bloco está preso. Este movimento consiste em um movimento de subida e descida e em outro de avanço. Cada vez que o braço contendo o bloco completa um curso, o bloco é submetido à face afiada de uma navalha de aço e uma fatia delgada de parafina contendo tecido é cortada. Estes cortes sâo então colocados em um banho maria histológico, que contém água aquecida, com a finalidade de distender os cortes, retirando pequenas dobras que se formaram durante a microtomia.
Coloração e montagem – os cortes finos (5 micrômetros=5milésimos de milímetro) que foram obtidos no passo anterior não podem ser vistos sob o microscópio pois apresentam-se transparentes. Há necessidade de corá-los para que sejam examinados. A maior parte das observações histológicas é feita em lâminas coradas pela hematoxilina e eosina. Um é básico e cora as estruturas ácidas em azul (que por isso são chamadas de basófiilas) e o outro é ácido e cora as estruturas básicas (portanto acidófiilas) em vermelho. Antes de corar as lâminas há necessidade de se retirar a parafina nos quais os cortes acham-se incluídos. Isto é feito submetendo-se os cortes, já aderidos à lâmina, a sucessivos banhos em xilol. A seguir os cortes são submetidos a banhos em álcool em concentração decrescente até serem hidratados, uma vez que o primeiro corante (hematoxilina) é uma solução aquosa. Depois disso oa lâmina é lavada para retirada do excesso de corante e corada com a eosina, aque pode ser aquosa ou alcoólica. Depois da coloração o material é novamente desidratado e coberto por uma lamínula de vidro, que é montada na lâmina com um meio de montagem que tem índice de refração semelhante ao do vidro.
Microscopia óptica (de luz)
Lente ocular (1)
Revólver das objetivas (2)
Parafuso macrométrico (4) para focalização da imagem
Parafuso micrométrico (5) para focalização da imagem
Mesa (onde a lâmina é colocada) (6)
Diafragma e condensador (8)
Sistema de parafusos para movimentação em dois eixos da mesa com a lâmina (9)
A microscopia de luz utiliza a luz para a formação de imagens, em oposição ao microscópio eletrônico que utiliza feixes de elétrons. Uma lâmpada é a fonte de luz, que passa por um diafragma íris (que elimina os raios de luz periféricos), depois passa por um sistema de lentes (condensador), que concentra a luz em uma pequena área e por um filtro azul (que torna a luz amarela em luz branca). A luz então atravessa a lâmina que contem a preparação histológica e alcança a objetiva. Esta é um sistema de lentes que produz uma ampliação inicial. Normalmente as objetivas trazem gravadas no seu corpo uma série de informações, entre elas o número de aumentos que produzem. A objetiva de 100 aumentos é chamada de objetiva de imersão pois há necessidade de usar uma gota de óleo de imersão entre a sua extremidade e a lâmina a ser examinada para que se obtenha o foco. As demais são as objetivas secas pois não necessitam do óleo.
Depois de formada a imagem inicial esta é projetada na extremidade da lente ocular que a amplia outra vez. Para sabermos o valor do aumento final da imagem basta multiplicarmos o número de aumentos da objetiva, pelo número de aumentos da lente ocular. Habitualmente a ocular aumenta 10 vezes e a maior objetiva seca é de 40 aumentos. Com isso geralmente o maior aumento é de 400 vezes. Com a objetiva de imersão habitualmente temos 1000 aumentos (10 vezes 100).
Os microscópios binoculares necessitam de um prisma entre a objetiva e a ocular para projetar a mesma imagem em ambas as oculares.
3. Microscopia virtual
É a técnica de obter, armazenar e transmitir imagens microscópicas em redes de computadores. As imagens são obtidas através de microscópios ópticos acoplados a scaners digitais Isto permite observação independente das imagens por um grande número de pessoas em localidades diversas. Esta técnica une técnicas de microscopia e de tecnologia digital.
As lâminas utilizadas em microscopia digital são as mesmas utilizadas na microscopia digital e são escaneadas utilizando-se um microscópio acoplado a um sistema computadorizado de fotografia digital que fotografa cada um dos campos microscópicos e depois junta as imagens por meio de software, otendo assim uma imagem da lâmina inteira na ampliação escolhida.
No momento da exibição da imagem há necessidade de um software específico que monta a imagem a partir de diversas pequenas imagens armazenadas no servidor.
Imaginemos que o piso inteiro do laboratório é a imagem guardada no servidor. Este piso é formado por muitos quadrados de cerâmica. Caso nós queiramos olhar uma área pequena deste piso, ela será coberta por 4 ou 8 quadrados e é isto que o software faz. Ele busca estes 4 ou 8 quadrados e os "costura" uns aos outros formando a imagem que desejamos. Quando nós movemos nossa observação para outra área, ele busca novos quadrados e forma nova imagem.
Observem na captura de tela acima os elementos contidos na página, que exibe uma lâmina de pele do dedo. À esquerda existe uma coluna com uma foto da lâmina completa; logo abaixo há informações sobre a lâmina e uma descrição. Na parte superior direita há um pequeno quadrado com a imagem da lâmina, uma escala de aumentos e uma barra na qual podemos mudar o brilho da imagem. Note que há um retângulo amarelo, que mostra qual área está ampliada na porção maior da tela, onde vemos a lâmina em estudo. Esta imagem pode ser movida em qualquer direção, usando-se o cursor do mouse.