43603 - Identificação bioquímica e molecular de linhagens de Pseudomonas aeruginosa isoladas de solo
Descrição: INTRODUÇÃO
Pseudomonas aeruginosa é um bacilo gram-negativo não fermentador, aeróbio estrito, pertencente à família Pseudomonadaceae. Microscopicamente, a bactéria é definida como um bacilo gram-negativo reto, não esporulado, móvel, contendo um flagelo polar. Macroscopicamente, a P. aeruginosa cresce formando colônias irregulares numa ampla variedade de temperaturas e em muitos meios de cultura usados no laboratório. A maioria das cepas produz pigmentos hidrossolúveis tais como a piocianina, a pioverdina e a piorrubina, os quais conferem ao meio de cultura coloração azul, esverdeada e marron, respectivamente (TRABULSI et al., 2005; NISENGARD e NEWMAN, 1997). O cetrimida agar é usado para o isolamento seletivo da Pseudomonas aeruginosa proveniente de amostras clínicas e outros materiais. A peptona serve como fonte de nitrogênio e o glicerol é usado como carbono e fonte de energia. A produção de piocianina é estimulada pelo cloreto de magnésio e o sulfato de potássio presentes no meio. A cetrimida (brometo de cetiltrimetilamina) é um composto amônio quaternário, que inibe uma vasta variedade de outros organismos, incluindo outras espécies de Pseudomonas.
P. aeruginosa é uma bactéria ubiquitária, sendo encontrada no solo, na água, nos vegetais, nos alimentos, sanitários, equipamentos de tratamentos respiratórios e diálise e nos mais diversos ambientes hospitalares (TRABULSI et al., 2005; MURRAY et al., 2004). É reconhecida como pertencente à microbiota normal da superfície de plantas, pele do homem e animais, porém sua relevância está em seu papel como patógeno oportunista, ocasionando infecções quando da redução dos mecanismos de defesa do hospedeiro (MAIA et al., 2009). Apresenta resistência a uma ampla variedade de condições físicas, incluindo capacidade de se multiplicar mesmo sob refrigeração, com elevadas concentrações de corantes e sais, propriedades que contribuem para sua presença em diversos ambientes (PIRNAY et al., 2005). É uma bactéria altamente oportunista, invasiva, toxigênica, e apresenta fatores de virulência capazes de inativar o sistema imune e a ação de muitos antibióticos (KONEMAM, 2008).
Possui resistência intrínseca a vários antimicrobianos devido à baixa permeabilidade de sua membrana e à sua capacidade de formar biofilme, ou pode adquirir resistência pela associação, no solo, com microrganismos naturalmente produtores de antibióticos. Devido à sua presença em uma grande diversidade de ambientes, pode carrear plasmídios e genes que lhe conferem multirresistência (MAIA, 2009).
- Isolar bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosas presentes no solo.
- Identificar os isolados obtidos por métodos bioquímicos e moleculares
Isolamento e caracterização bioquímica das linhagens presentes no solo
O isolamento das linhagens de P. aeruginosa de solo será realizado de acordo com a metodologia descrita por Mukherjee et al. (2010). De cada amostra, 1g de solo foi adicionado a um tubo contendo 9 mL de solução fisiológica 0,9% esterilizada. Os tubos contendo o material foram agitados vigorosamente em um vórtex e quatro diluições seriadas foram realizadas. Um volume de 200 µL de cada diluição foi inoculado em placa de Ágar cetrimida com auxílio de uma alça de Drigalski, e as placas incubadas a 37 ºC por até 72 horas.
Os testes confirmatórios serão obtidos pela detecção de fluorescência em UV (365nm), pela formação de pigmento e por testes bioquímicos com base na utilização de citrato como única fonte de carbono no meio ágar citrato de Simmons, mobilidade, ausência da produção de indol e de sulfeto de hidrogênio no meio SIM e pelo teste de oxidase, utilizando tiras de oxidase da Laborclin.
Confirmação do isolamento das linhagens de P. aeruginosa por PCR para o gene oprL
As linhagens de P. aeruginosa isoladas pela metodologia descrita no item anterior serão submetidas ao ensaio de PCR para detecção do gene oprL, o qual codifica uma lipoproteína de membrana externa e é específico para linhagens de P. aeruginosa. O ensaio será realizado segundo Vos et al., 1997; utilizando os seguintes iniciadores: PAL1, 5' -ATGGAAATGCTGAAATTCGGC-3' e PAL2, 5' -CTTCTTCAGCTCGACGCGACG-3'.
KONEMAN, E.W. et al . Diagnóstico Microbiológico - Texto e Atlas Colorido. 6ª ed. Rio de Janeiro: Medsi, 2008.
MAIA, A. A., et al. 2009. Resistência antimicrobiana de Pseudomonas aeruginosa isolados de pescado e de cortes e de miúdos de frango. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 29: 114-119.
MUKHERJEE, K., TRIBEDI, P., CHOWDHURY, A., RAY, T., JOARDAR, A., GIRI, S., SIL, AK. 2010. Isolation of a Pseudomonas aeruginosa strain from soil that can degrade polyurethane diol. Biodegradation, In press.
MURRAY, P.R.; et al. Microbiologia Médica. 4ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
NEWMAN, M. G., NISENGARD, R. J. Microbiologia Oral e Imunologia. 2ª Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1997.
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TRABULSI, L. R. et al. Microbiologia. 4ª ed. São Paulo: Atheneu, 2005.
VOS D., LIMA Jr. A., PIRNAY JP., DUINSLAEGER L., REVETS H., VANDERKELEN A., HAMERS R., CORNELIS P. 1997. Analysis of epidemic Pseudomonas aeruginosa isolates by isoeletric focusing of pyoverdine and RAPD-PCR: modern tools for an integrated anti-nosocomial infection strategy in burn wound centers. Burns 23: 379-386.