A documentação que possuímos não permite saber o que provocou o enfado e a decisão do Papa. Galileu sempre atribuiu a isto a atuação de seus inimigos (que não eram poucos nem pouco influentes), que teriam informado ao Papa de modo tendencioso, predispondo-o contra. Por exemplo, além de denunciar que o livro defendia o copernicanismo, sendo contra o decreto de 1616, teriam colocado em relevo que um dos três personagens, Simplício, que sempre costumava perder, é quem expõe o argumento preferido do Papa sobre a onipotência de Deus e os limites de nossas explicações. Isto poderia parecer uma provocação deliberada, e parece que foi assim interpretado: vários anos depois, Galileu ainda enviava uma mensagem ao Papa, da sua vila de Arcetri, fazendo-se saber que jamais havia passado por sua mente tal coisa. Além disso, como foi assinalado, as circunstâncias pessoais de Urbano VIII naquele momento eram difíceis, e não podia tolerar que se publicasse um livro, que aparecida com a permissão eclesiástica de Roma e de Florença, em que se defendia uma teoria condenada pela Congregação do Índex em 1616 como falsa e contrária a Sagrada Escritura.
O Papa estabeleceu uma comissão para examinar as acusações contra Galileu e julgou que o assunto devia ser enviado ao Santo Ofício (ou Inquisição romana), de onde foi ordenado a Galileu, que vivia em Florença, que se apresentasse em Roma ante esse tribunal durante o mês de outubro de 1632. Depois de tentativas de prorrogação que duraram vários meses, em 30 de dezembro de 1632, o Papa com a Inquisição deu a conhecer que, se Galileu não se apresentasse em Roma, enviaria alguém que se certificasse de sua saúde e se visse que poderia ir a Roma, o levaria preso. O Papa aconselhou seriamente ao Grande Duque que se abstivesse de intervir, porque o assunto era sério. As autoridades toscanas decidiram aconselhar a Galileu que fosse a Roma. O Embaixador Noccolini, que conhecia bem ao Papa e falava com ele com freqüência, advertia que discutir com o Papa e contrariá-lo era o melhor caminho para arruinar a Galileu. Quando o Papa falava com Niccolini do problema causado por Galileu, em várias ocasiões encheu-se de cólera. Todos advertiram Galileu que era melhor ir a Roma e se mostrasse em todo o momento disposto a obedecer no que dissessem, porque se tomasse outra atitude as conseqüências seriam prejudiciais para ele.
Galileu chegou a Roma no domingo dia 13 de fevereiro de 1633, em um liteira facilitada pelo Grande Duque, depois de esperar na fronteira dos Estados Pontifícios por causa da peste que seguia em Florença. O embaixador de Toscana, Francesco Niccolini, se portou maravilhosamente com Galileu, intervindo continuamente em seu favor ante as autoridades de Roma, de acordo com as instruções do Grande Duque, Conseguiram que Galileu não estivesse no cárcere do Santo Ofício, como exigia a norma. Desde sua chegada à Roma até 12 de abril (dois meses), Galileu viveu no Palácio de Florença, onde se encontrava a embaixada de Toscana e a casa do embaixador. As autoridades o recomendaram que evitasse a vida social, de modo que não saía de casa, mas gozava de um tratamento excepcional por parte do embaixador e de sua esposa. Niccolini pedia ao Papa que o assunto fosse o mais breve possível, mas se alongava porque a Inquisição ainda estava deliberando sobre o modo de atuar. Como se descobriu nos arquivos do Santo Ofício o escrito de 1616 em que proibia Galileu de tratar de qualquer modo o copernicanismo, o processo se centrou completamente em uma única acusação: a desobediência desse preceito em 1616.
Galileu foi chamado a depor no Santo Ofício na terça-feira 12 de abril de 1633. Sua defesa pode nos parecer muito estranha: negou que, no Diálogo, defendesse o copernicanismo. Galileu sabia que o Santo Ofício pediu a opinião de três teólogos a respeito e que, em 17 de abril, os três informes concluíam sem lugar a dúvidas (como de fato assim o era) que Galileu, em seu livro, defendia o copernicanismo; neste caso, os teólogos tinham razão. Isto complicava a situação, pois um acusado que não reconhecia um erro comprovado devia ser tratado muito severamente pelo tribunal. Por outro lado, Galileu se defendeu mostrando uma carta que, a seu pedido, o cardeal Balarmino tinha escrito depois dos acontecimentos de 1616, para que pudesse se defender frente àqueles que o caluniavam; nesse escrito, Belarmino dava fé de que Galileu não teve que abjurar de nada e que simplesmente tinha sido notificada a proibição da Congregação do Índex. Mas isso podia ser interpretado também contra Galileu se fosse mostrado, como era o caso, que em seu livro argumentava a favor da doutrina condenada em 1616. O tribunal centrou-se em matizes da proibição feita a Galileu em 1616, que Galileu dizia não se lembrar, porque tinha conservado o documento de Balarmino e aí não se incluíam esses matizes. Desafortunadamente, Balarmino havia morrido e não podia esclarecer a situação.
Estes dias Galileu seguia no Santo Ofício, ainda que tampouco tivesse estado na prisão. Por deferência com o Grande Duque de Toscana e frente à insistência o embaixador, Galileu foi instalado nas habitações do fiscal da Inquisição, traziam-lhe comidas da embaixada de Toscana, e podia passear. Esteve ali desde a terça-feira 12 de abril até o sábado 30 de abril: 17 dias completos.
Para desbloquear a situação, o Padre Comissário propôs aos Cardeais do Santo Ofício algo insólito: visitar Galileu em suas estalagens e tentar convencê-lo a reconhecer seu erro. Conseguiu depois de uma longa conversa com Galileu em 27 de abril. No dia seguinte, sem comunicar a ninguém mais, escreveu o que tinha feito e o resultado ao cardeal sobrinho do Papa, que se encontrava nestes dias em Castelgandolfo com o Papa; através dessa carta se vê claramente que esta atuação estava aprovada pelo Papa: desse modo, o tribunal poderia salvar sua honra condenando a Galileu, e logo poderia usar clemência com Galileu deixando-o recluso em sua casa, tal como ( disse o Padre Comissário) sugeriu Vossa Excelência (o cardeal Francesco Barberini).
Com efeito, no sábado 30 de abril Galileu reconheceu perante o tribunal que, ao voltar a ler agora seu livro, que tinha acabado há muito tempo, se dava conta de que, devido não a má fé, mas a vanglória e ao desejo de se mostrar mais engenhoso que o resto dos mortais, tinha exposto os argumentos a favor do copernicanismo com uma força que ele mesmo não acreditava que tivesse. A partir daí, as coisas se desenrolaram como o Comissário tinha previsto. Esse mesmo dia foi permitido a Galileu voltar ao Palácio de Florença, à casa do embaixador. Na terça-feira 10 de maio foi chamado ao Santo Ofício para que apresentasse sua defesa; apresentou o original da carta do cardeal Belarmino, e reiterou que tinha atuado com reta intenção. Continuava fechado no palazzo Firenze; o embaixador conseguiu que lhe permitisse a passear na Vila Médici, e inclusive em Castelgangolfo, porque lhe causava mal não fazer nenhum tipo de exercício. Entretanto, a peste continuava açoitando Florença, em alguma carta o diziam que, no meio de sua desgraça, era uma sorte que não estivesse então em Florença.
Na quinta-feira 16 de junho, a Congregação do Santo Ofício tinha, a cada semana, sua reunião com o Papa. Nesta ocasião celebrou-se no palácio do Quirinal. Estavam presentes 6 dos 10 Cardeais da Inquisição, além do Comissário e do Assessor (nos interrogatórios e, em geral, em todas as sessões que foram mencionadas até agora, não estavam presentes os Cardeais: estavam os oficiais do Santo Ofício que transmitiam as atas à Congregação dos Cardeais, e estes, com o Papa, tomavam as decisões). Esse dia o Papa decidiu que Galileu fosse examinado sobre sua intenção com ameaça de tortura (neste caso tratava-se de uma ameaça puramente formal, já que se sabia de antemão que não se realizaria). Depois, Galileu devia abjurar da suspeita de heresia perante a Congregação em pleno. Seria condenado à prisão ao arbítrio da Congregação, seria proibido que no futuro tratasse de qualquer modo o tema do movimento da Terra, seria proibido o Diálogo. Também seria enviada uma cópia da sentença aos núncios inquisidores, sobretudo ao de Florença, para que a lesse publicamente em uma reunião na qual procuraria que se encontrassem os professores de matemática e filosofia. O Papa comunicou esta decisão ao embaixador Niccolini em 19 de junho. Niccolini pediu clemência, e o Papa, manifestando algo que, como se apontou, estava já decidido de antemão, lhe respondeu que, depois da sentença, voltaria a ver o embaixador para ver como se poderia arrumar para que Galileu não estivesse na prisão. De acordo com o Papa, Niccolini comunicou a Galileu que a causa seria terminada em seguida e o livro proibido sem dizer-lhe nada sobre o que tocava a sua pessoa, para não causar-lhe mais aflição.
Desde a terça-feira 21 de junho até sexta-feira 24 de junho, Galileu esteve de novo no Santo Ofício. Na quarta-feira dia 22, Galileu foi levado ao convento de Santa Maria sopra Minerva; foi lida a sentença (assinada por 7 dos 10 Cardeais do Santo Ofício) e abjurou de sua opinião sobre o movimento da Terra diante da Congregação. Foi, para Galileu, o mais desagradável de todo o processo, porque afetava diretamente a sua pessoa e se desenvolveu um público de modo humilhante. Na quinta-feira o Papa, com a Congregação do Santo Ofício reunida no Quirinal, concedeu a Galileu a prisão fosse comutada por arresto na Vila Médici, aonde se trasladou na sexta-feira dia 24. Na quinta-feira dia 30 foi permitido a Galileu abandonar Roma e trasladar-se a Siena, na Toscana, ao palácio do arcebispo. Galileu deixou Roma na quarta-feira 6 de julho e chegou a Siena no sábado 9 de julho. Tinha acabado o pesadelo romano.
A sentença da Inquisição começa com os nomes dos 10 cardeais da Inquisição, e acaba com as assinaturas de 7 deles. O Papa, junto com a Congregação, decidiu que Galileu fosse condenado e que abjurasse de sua opinião, mas no texto da sentença não aparece em nenhum momento citado o Papa; portanto, esse documento não pode ser considerado como um ato de magistério pontifício, e menos ainda como um ato de magistério infalível nem definitivo. No texto da abjuração se lê - maldigo e detesto os mencionados erros e heresias - ; mas não se trata de uma doutrina definida como heresia pelo magistério da Igreja: no texto da abjuração se diz, como assim é, que essa doutrina foi declarada contrária à Sagrada Escritura, e, como sabemos, esta declaração se fez mediante um decreto da Congregação do Índex, que não constituiu um ato de magistério infalível nem definitivo.