Filho de judeus imigrantes oriundos do Império Austro-Húngaro, Eisner nasceu no distrito do Brooklyn, Nova York, Estados Unidos, onde passou sua juventude.[2] Enquanto estudava no Instituto DeWitt Clinton, no também distrito nova-iorquino do Bronx, colaborou com Bob Kane na revista da escola. Em 1936 entrou para a equipe da revista WOW What a Magazine!, dirigida por Jerry Iger. No ano seguinte, com o fim da revista WOW. Eisner fundou com Iger o Eisner-Iger Studio, onde trabalharam grandes nomes das histórias em quadrinhos como Bob Kane e Jack Kirby.[3] Até 1939, Eisner criou diversas séries como a história de piratas Hawks of the Seas,[4] a garota das selvas Sheena,[5] a série de aventuras Captain Scott Dalton; a história de piratas; os super-heróis Wonder Man e The Flame,[6] a história de espionagem Harry Karry (com o pseudônimo de Bill Rensie), entre outras..
Ao fim da década, Eisner e Iger dividiram sua sociedade. Iger passou a ser diretor de publicações da editora Fiction House, e Eisner passou a criar quadrinhos para a Quality Comics Group.[7] Criou o personagem Doll Man e os da série Falcão Negro, ambientada na 2a Guerra Mundial. Dali, começou a produzir histórias no formato de 16 páginas do suplemento dominical dos jornais, onde apareciam sempre três histórias de várias páginas cada uma. A estreia foi em 2 de junho de 1940, e no princípio incluía The Spirit, Lady Luck e Mr. Mystic.
The Spirit é a história de um detetive mascarado, Denny Colt, um herói sem superpoderes que protege os habitantes da cidade fictícia de Central City. A série se destacou pela inovação dos enquadramentos quase cinematográficos, os efeitos de luz e sombra e as inovadoras técnicas narrativas, além da qualidade do roteiro e da arte. Sempre a presença de belas mulheres, cenas hilariantes, melodramáticas, mas que enfatizavam sobretudo o aspecto humano dos personagens. Em 13 de outubro de 1941 The Spirit começou a ser também publicado como tira diária.[8] Eisner deixou a série em 1942 ao ser mobilizado pela Segunda Guerra Mundial, onde produziu pôsteres, ilustrações e histórias propagandísticas para o exército norte-americano.
A série The Spirit, que havia sido continuada por outros artistas devido à sua ausência, foi retomada por Eisner em 1945. Como página dominical, The Spirit prosseguiu até 28 de setembro de 1952, e é considerada uma das obras mais importantes das histórias em quadrinhos.[carece de fontes?]
Ao mesmo tempo que desenhava The Spirit, Eisner fundou a American Visuals Corporation, empresa dedicada a criação de comics, vinhetas humorísticas e ilustrações, que acabou absorvendo a maior parte do seu tempo, separando-lhe da criação de histórias. Somente quando o editor holandês Olaf Stoop reeditou The Spirit, no começo dos anos 70, Eisner voltou a interessar-se pela criação de histórias em quadrinhos. Em 1978 criou Um Contrato com Deus (A Contract With God), que consiste em quatro histórias acerca da vida no Bronx nos anos 30. Um Contrato com Deus tem com freqüência, embora erroneamente, sido citada como a primeira graphic novel, no entanto, cartunista Richard Kyle tinha usado o termo em 1964, em um ensaio publicado no fanzine Capa-Alpha,[9][10] além de ter aparecido na capa da The First Kingdom (1974) de Jack Katz, com quem Eisner se correspondia.[11]