Subsídios à transformação genética de plantas de Catasetum pileatum (Orchidaceae) por meio de tecidos merismáticos radiculares e caulinares - USP
Subsídios à transformação genética de plantas de Catasetum pileatum (Orchidaceae) por meio de tecidos merismáticos radiculares e caulinares
Shigihara, Cintia Tiemi
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP; Universidade de São Paulo; Instituto de Biociências 2008-05-05
Autor: Shigihara, Cintia Tiemi
Orientador: Kerbauy, Gilberto Barbante
Assuntos: Catasetum Pileatum; Meristemas; Transformação Genética; Catasetum Pileatum; Genetic Transformation; Meristems
Descrição: Os estudos sobre a conversão in vitro de meristemas apicais radiculares em gemas caulinares de plantas do gênero Catasetum vêm contribuindo para uma melhor compreensão dos processos de competência, indução e determinação celular no processo de desenvolvimento, necessitando, no momento, de aprofundamento em estudos moleculares. Para tanto, a utilização de plantas transgênicas representa uma ferramenta de trabalho importante. Além disso, os métodos de transformação genética acenam como uma alternativa eficaz para o melhoramento de plantas de interesse econômico com ciclos reprodutivos longos, como as orquídeas. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estabelecer um protocolo para transformação genética de Catasetum pileatum, utilizando tecidos meristemáticos como explantes alvos. Para tanto, avaliou-se o potencial de alguns promotores na expressão de uidA em tecidos de C. pileatum, dentre os quais destacaram-se o 35S de CaMV, o promotor do gene Pthi1 e o de PTE027, sendo que os dois primeiros foram utilizados para os experimentos de transformação genética permanente. Como explantes alvos para a transformação, foram testadas tanto gemas laterais de caules estiolados (CEs) quanto ápices radiculares (ARs), além de segmentos radiculares subapicais (SRs). Para obtenção de estruturas com maior quantidade de células em divisão celular, foi estabelecido um protocolo de cultura de tecidos a partir de segmentos radiculares subapicais (SRs). Na região proximal destes segmentos, estabeleceu-se uma estrutura globular e intumescida na presença de 0,5mg.L-1 de BA. Cortes histológicos destas intumescências revelaram a presença de grande quantidade de células em intensa divisão celular, levando, em estágios mais avançados, à formação de gemas caulinares superficiais. Estas originavam plantas após um mês em meio propício para este fim. Estes explantes foram submetidos a várias concentrações de higromicina, sendo que as concentrações escolhidas para seleção de tecidos transformados foram de 25mg.L-1 para CEs e ARs e 10mg.L-1 para SRs. CEs e ARs foram bombardeados com micropartículas de tungstênio contendo DNA plasmidial adsorvido (P35S:uidA ou Pthi1:uidA) e transferidos para meio seletivo após uma, duas ou três semanas. No entanto, estes não foram capazes de sobreviver em meio seletivo após dois meses de seleção. SRs foram bombardeados com P35S:uidA ou Pthi1:uidA. Estes foram capazes de expressar uidA entre 48h até quatro semanas, sendo que após três meses de seleção, foi observada uma gema azul transformada com Pthi1. As melhores condições para a transformação foram as seguintes: bombardeamento dos SRs recém-isolados, manutenção por duas semanas em meio não seletivo e, por fim, transferência para meio com higromicina até o término de três meses. Não obstante a necessidade de refinamentos dos procedimentos utilizados e de análises moleculares adicionais, estes resultados constituem os primeiros a indicarem a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de Catasetum pileatum.