ReP USP - Detalhe do registro: Isolamento de mutantes nocaute de Xanthomonas Axonopodis PV citri afetados nos genes male e moda codificadores de componentes ligadores do sistema de captação de maltose e molibdato respectivamente
Balan, A. F.
Ferreira, R. C. C.
Abstract: Objetivos: Gerar mutantes Xanthomonas axonopodis pv citri afetados nos genes malE e modA dos sistemas de captação de maltose e molibdato, utilizando técnicas de mutagênese sítio dirigida do tipo nocaute por inserção de cassete de resistência a espectinomicina. Métodos e Resultados: Uma cópia mutada do gene malE foi gerada pela clonagem de um cassete de resistência a espectinomicina dentro d o s'tio de Eco RI localizado 571 e 751pb do gene clonado. Uma cópia mutada do gene modA foi obtida pela mesma estratégia usando o sítio de BamHI localizado na posição 363pb do gene clonado. Os genes mutados foram subclonados em um plasmídeo suicida derivado R6K gerando pMalE36 e pModA35. O resultado do plasmídeo recombinante foi introduzido dentro da linhagem Xac 306 por eletroporação usando condições otimizadas previamente pelo nosso grupo. Colônias foram selecionadas por troca alélica após dois passos de procedimentos baseados primeiramente na resistência a espectinomicina, e o segundo passo, pela resistência a sacarose, devido a perda do gene sacB presente no vetor suicida. Colônias resistentes a espectinomicina e a sacarose mostraram carregar o alelo mutado como um resultado de um evento de dupla recombinação, como demonstrado pelas análises de "Southern blot" e PCR. Conclusão: Foi possível criar linhagens mutadas de Xac 306, nos genes modA e malE por meio de recombinação sitio específica. O papel fisiológico dos sistemas de captação poderão ser avaliados em ensaios cujasfontes nutricionais são maltose e molibdato