A pintura apresenta uma mulher sentada, mostrando apenas a parte superior do seu corpo; no fundo, uma paisagem que mistura a natureza (as águas, as montanhas) e a ação humana (os caminhos). O corpo da modelo surge numa estrutura piramidal: na base estão as suas mãos, no vértice superior o seu rosto.
O sorriso ambíguo de Mona Lisa é, sem dúvida, o elemento do quadro que mais tem captado a atenção de quem o observa. Potenciou diversas leituras e teorias, inspirando textos, músicas, filmes, entre outros.