Transarterial hepatic chemoembolization: an experimental model in rats
http://dx.doi.org/10.1590/S0102-86502004000500009
Quimioembolização transarterial hepática: modelo experimental de tumor em ratos1
Jamil M. ZarurI; Marjorie S. Façanha BarretoII; Clarissa Alencar DiogenesII; Germana Lopes do NascimentoII; Manoel Odorico MoraesIII
ICirurgião, Mestrando em Cirurgia na UFC
IIAluna do Curso de Medicina de UFC
IIIDoutor em Farmacologia, Professor Adjunto de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da UFC, Professor da Pós-graduação do Departamento de Cirurgia da UFC
OBJETIVO: Estabelecer um modelo de tumor no fígado de ratos para estudo do comportamento tumoral e avaliar o uso da quimiembolização transarterial.
MÉTODOS: Utilizou-se oitenta e oito ratos Wistar, fêmeas, adultos, pesando entre 175- 284 g . Realizado incisão abdominal de 3 cm e implantou-se o carcinossarcoma de Walker 256 no lóbulo esquerdo do fígado. Dividiu-se em três grupos que receberam respectivamente 100x 103 , 200x 103 e 300x 103 células tumorais, avaliado a pega do tumor e a sobrevida. Em outro grupo de experimento com 39 animais inoculados com tumor de Walker foi avaliado a sobrevida dos animais após infusão do 5-Flourouracil (5-FU) por via intra-peritoneal e intra-arterial.
RESULTADOS: O implante do carcinossarcoma de Walker no fígado de ratos apresentou desenvolvimento de 100 %, teve um crescimento rápido e desenvolvimento de metástases tardiamente, levando os animais ao óbito entre o sétimo e décimo quinto dia. A quimiembolização transarterial é possível de ser realizada experimentalmente. O uso do 5-FU aumentou a sobrevida em comparação ao grupo controle.
CONCLUSÃO: O modelo de implante do tumor de Walker no fígado de ratos é eficiente, de fácil reprodutibilidade, e sobrevida média de 9,96±0.3 dias. A quimioterapia transarterial hepática pode ser realizada experimentalmente para avaliar diversas drogas.
Descritores: Modelo tumor hepático. Carcinossarcoma de Walker. Quimioembolização.
PURPOSE: An animal model to study the behaviour of liver tumor in rat and its response after use of transarterial chemoembolization.
METHODS: We use 88 Wistar rats, all of them were females, adult, weight 175-284 g. Abdominal incison of three cm and implanted the Walker carcinossarcoma 256 at left lobule of the liver. The animals were divided into three grups, that received 100x103 , 200x103, and 300x103 cells. Followed up the animas to avaliate life standing and tumoral development. In another experiment was used 39 animals which already had Walker 256 tumor and we study the survival of the animals after treatment with 5-FU IP or 5-FU IA.
RESULTS: The orevall tumor development rate were 100%. Tumor growth was fast, and devolopment metastases on old fase. The animals dead between 7º and 15º day. Its possible to do chemoembolization experimentaly, after the use of 5-FU the rate survival increased.
CONCLUSION: The model with Walker 256 tumor developed here is easy to repoduce, efficient, with high tumor development rate observed, the life standing is about 9,96 ± 0,3 days. The chemoembolization experiment allows to assess several drugs.
Key words: Liver tumor model. Walker's carcinosarcoma. Chemoembolization.
Os tumores primários do fígado e metastáticos apresentam prognósticos ruins, não existindo uma terapêutica eficaz quando em estágios avançados, assim a busca de novas modalidades de tratamento se faz necessária. O estudo experimental é uma forma de testar novas drogas e formas de tratamento.
Idealizamos um modelo experimental utilizando ratos, que foram inoculados com o carcinossarcoma 256 de Walker em diferentes quantidades de células, acompanhado seu desenvolvimento, evolução e sobrevida.
Conhecida a evolução natural do tumor, comparamos o uso do 5-Flourouracil ( 5-FU) administrado por via intraperitoneal e por via intra-arterial, na artéria hepática, juntamente com partículas de polivinil alcool ( PVA) de 45 a 150 microns.
A quimioembolização tem sido utilizada para o tratamento dos tumores hepáticos em estágios avançados, porém seus efeitos, complicações e qual droga apresenta benefícios ainda não são conhecidas.
O tumor de Walker vem sendo mantido no Laboratório de Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará através de transplantes sucessivos a cada 8 dias, por inoculação via intramuscular na pata traseira de ratos Wistar. O tumor é retirado dos animais doadores e colocado em uma placa de Petri contendo 9ml de Ringer com lactato e 1 ml de gentamicina ( 10mg/ml). O tecido é separado de focos necróticos e triturado em pequenos fragmentos, em seguida colocados em um Erlenmeyer estéril e submetidos a um agitador com bala magnética por 5 minutos. A solução é então filtrada e colhido 106 células tumorais para nova manutenção do tumor ou experimentos .
Para inoculação no fígado de ratos, foi utilizado ratos Wistar, fêmeas com peso entre 175 a 284 g. A pesquisa foi aprovada pela comissão de ética de experimentos em animais.
Realizado incisão mediana abdominal de 3 cm, estando os animais sob anestesia com hidrato de coral a 10% na dose 0,1 ml/ 30 gamas de peso por via intraperitoneal . Uma solução de 0,1ml com o tumor de Walker era inoculada utilizando-se uma seringa de 1 ml e agulha 30 G1/2 sob visão direta no lóbulo esquerdo do fígado. Após a inoculação a parede abdominal era suturada com mononylon 5.0 em plano único e mantidos em observação até sua recuperação anestésica e posteriormente mantidos no biotério até sua morte ou sacrifício (Figura 1).
Para realização do trabalho separamos em grupos de experimentos. O primeiro experimento teve a finalidade de estabelecer a quantidade de células que seriam necessárias para o desenvolvimento do tumor. Para tanto, três animais foram inoculados com 100x103 células do tumor, três animais foram inoculados com 200x103 células e um terceiro grupo de três animais foram inoculados com 300x103 células do tumor de Walker, os animais eram sacrificados no 6º dia e analisados macroscópicos e microscopicamente.
No segundo experimento os animais foram inoculados com 100x103 células ( grupo A1 ), 200x103 células ( grupo A2 ) e 300x103 células ( grupo A3 ) do tumor de Walker e observados até a sua morte espontânea, esse grupo teve a finalidade de estudar a sobrevida dos animais. Após a morte espontânea realizava-se a necropsia com inventário da cavidade abdominal e torácica retirada do fígado com o tumor para estudo de microscopia, realizava-se ainda as medidas do tumor com uso de um paquímetro para cálculo do volume tumoral . Foram utilizados um total de quarenta ratos Wistar, distribuídos em treze no grupo A1, quinze no grupo A2 , e doze no grupo A3 .
Em um terceiro experimento os animais foram inoculados com 100x103 células do tumor de Walker e divididos em três grupos. No grupo B1 , grupo controle, no 6º. dia após a inoculação os animais eram submetidos a novo procedimento cirúrgico com abertura da cavidade peritoneal, no pedículo hepático identificava-se e cateterizava-se a artéria hepática com cateter de 0,85mm de diâmetro ( Figuras 2 e 3 ), era então infundido 1 ml de solução salina, após realizava-se sutura do orifício de entrada do cateter com fio cirúrgico prolene 7.0 e fechamento da cavidade abdominal. O grupo B2 , no 6º. dia após a inoculação administrava-se 5-Fluorouracil intra-peritoneal da dose de 130 mg/massa corporal (m2) . No grupo B3 , também no 6º. dia após a inoculação os animais eram submetidos a novo procedimento cirúrgico com abertura da cavidade peritoneal, identificação e cateterização da artéria hepática e infundia-se 5-Fluorouracil intra-arterial na dose anteriormente descrita juntamente com 200mg/kg de Polivinil alcool ( Contour® , Boston Cientific , USA) (diâmetro de 45 – 150 microns). Os animais eram então mantidos em observação até sua morte, foram utilizados neste terceiro experimento trinta e nove animais, distribuídos em 12 no grupo B1, 12 no grupo B2 e 15 no grupo B3.
Realizado análise estatística pelo método de Kaplan-Meier e a diferença de sobrevida entre os grupos pelo teste de Log Rank, sendo os valores de p < 0,05 considerados significantes.
No primeiro experimento após o sacrifício dos animais no 6º dia foi encontrado o tumor de Walker no fígado de todos os ratos. A pega do tumor foi de 100%. Formavam massa tumoral no local do implante, de cor clara e consistência endurecida, com cerca de 0,5 cm de diâmetro, havia invasão de estruturas contíguas em alguns casos, porém não encontramos implantes na cavidade abdominal ou em outros órgãos. À microscopia encontramos células tumorais do carcinossarcoma 256 de Walker agrupadas, em algumas amostras as células tumorais estavam presentes no sinusóides hepáticos (Figura 4).
No segundo experimento os animais foram a óbito entre o sétimo e o décimo quinto dia. No grupo A1 os animais tiveram óbito entre o 9º e o 15º dia, a sobrevida média foi de 10,23 dias . No grupo A2 as mortes ocorreram entre o 9º e 11º dia, a sobrevida média foi de 9,73 dias . No grupo A3 os óbitos ocorreram entre o 7º e 14º dia, com sobrevida média de 10,0 dias. Não ocorrendo diferença estatística da sobrevida entre os grupos(Figura 5). O volume do tumor variou de 0,016 cm3 a 0, 426 cm3 com média de 0,173 cm3.
No terceiro experimento os animais que tiveram morte decorrentes do procedimento cirúrgico foram retirados do experimento. O grupo controle ( grupo B1 ) teve uma sobrevida média de 10,58 dias, os animais tiveram óbito entre o 9º e o 11º dia. O grupo B2 com infusão de 5-FU intraperitoneal teve sobrevida média de 11,9 dias, as mortes ocorreram entre o 10º e 14º dia e no grupo B3 com infusão intra-arterial a sobrevida média foi de 12,27 dias os animais tiveram óbito entre o 11º e o 15º dia (Figura 6).
A analise estatística pelo de método de Kapan-Meier com análise da sobrevida pelo teste de Log Rank mostrou significância estatística entre o grupo controle e o grupo com infusão de 5-FU por via peritoneal ( p < 0,020 ) e entre o grupo controle e o grupo com infusão intra-arterial ( p < 0,063 ). Entre o grupo B2 e B3 não houve diferença estatística ( p = 0,44 )
Modelos experimentais de tumores no fígado de ratos já foram desenvolvidos através da inoculação do tumor no baço e em veias do sistema mesentérico que drenaram através da veia porta para o fígado, porém apresentam desenvolvimento tumoral variável e com baixa mortalidade1,2.
A indução de lesões cancerígenas no fígado de ratos também foi desenvolvido com o uso de N-nitrosodiethylamine3, p-dimetil-aminoazobenzene, 2-acetilaminofluorene, e 2-diacetilaminofluorene por via oral através da dieta durante 4 a 6 meses4.
A indução de tumor no fígado de ratos através da inoculação direta foi utilizado com vários tipos de células tumorais, como o de Novikoff, o adenocarcinoma do colon CC5315 e células tumorais de Lewis6 . O tumor de Walker foi utilizado como modelo pelo implante direto no fígado de ratos, o modelo mostrou ser reprodutível com elevada taxa de desenvolvimento e características de crescimento local. Apresenta suprimento sangüíneo principalmente pela artéria hepática, com hipervacularização, similar como o HCC7
O uso de tumor VX2 no coelho através do implante direto ou na veia mesentérica é um modelo bem conhecido e bastante utilizado para avaliar meios de diagnósticos de imagem e ação terapêutica de medicamentos8.
O uso do tumor carcinossarcoma de Walker vem sendo utilizado no laboratório de Cirurgia experimental da Universidade Federal do Ceará para inoculação em diversos órgãos de ratos, como estômago, pulmão e rins 9,10,11.
O implante do tumor de Walker no fígado de ratos através da inoculação direta demostrou ser uma técnica fácil, e pega de 100%. Demostra ser um tumor agressivo com crescimento no parênquima hepático e invasão por contiguidade, a taxa de sobrevida é pequena e sem diferenças significativas com as diferentes quantidades de células implantadas e por nós utilizados. O procedimento de infusão de drogas na artéria hepática requer conhecimento da anatomia e material cirúrgico adequado. A via de administração intra-arterial não alterou a sobrevida com o uso do 5-FU no presente trabalho.
Modelos animais de tumor hepático vêem sendo utilizados para o desenvolvimento e aprimoramento de meios diagnósticos por imagem 12,13,14,15 e para testes de novas terapias farmacológicas16,17, cirúrgicas e meios físicos de hipertermia e hipotermia.
A quimioembolização tem sido considerado como efetivo no tratamento do carcinoma hepatocelular (HCC) em pacientes que não são candidatos a cirurgia. Mas grandes variações no método empregado e nas drogas utilizadas diferem bastante nos estudos já realizados. A reprodução de um modelo animal para realizar quimioembolização irá ajudar no conhecimento desta nova técnica, estudando as diferentes estratégias terapêuticas e avaliando as reações adversas relacionadas com a quimioembolização transarterial.
O modelo de implante de tumor carcinossarcoma de Walker em fígado de ratos Wistar provou ser bastante eficaz, o procedimento de implantação é simples e rápido, o tumor tem crescimento rápido e com sobrevida média de 9,96±0,3 dias. Demonstra ter comportamento tumoral restrito ao fígado formando massa tumoral de 0,173 cm3. O procedimento de cateterização da artéria hepática é possível e requer experiência. O modelo experimental pode ser assim utilizado para linhas de pesquisa que avaliem drogas quimioterápicas por via transarterial.
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Recebimento: 03/06/2004
Revisão: 10/07/2004
Zarur JM, Barreto MSF, Diógenes CA, Nacimento GL, Moraes MO. Quimioembolização transarterial hepática um modelo experimental de tumor em ratos. Acta Cir Brás [serial online] 2004 Set-Out;19(5). Disponível em URL: http://www.scielo.br/acb [também em CD-ROM].
1. Trabalho realizado no Laboratório de Oncologia Experimental (LOE) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).