Para se determinar a voltagem que será utilizada deve-se computar a distância entre os eletrodos e não o comprimento do gel. Geralmente usa-se uma voltagem de 1 a 5 V/cm. Voltagens excessivas ou muito baixas interferem na mobilidade do DNA e causam distorções na migração. Para cubas rotineiramente utilizadas pela maioria dos laboratórios de pesquisa, a voltagem varia entre 50 e 110 V.
Durante a corrida o DNA sairá do poço, penetrará no gel, migrando em direção ao pólo positivo. Com isso os fragmentos serão separados de acordo com o tamanho. Os fragmentos menores migram mais rapidamente que os fragmentos maiores, pois eles apresentam maior facilidade de atravessar os poros da matriz de agarose em direção ao pólo positivo. Enquanto que fragmentos de mesmo tamanho migram praticamente juntos.
No caso da utilização do azul de bromofenol, quando este atingir ¾ do gel a corrente pode ser desligada. Entretanto, há variações de acordo com o tamanho do fragmento de DNA de interesse. Se o fragmento for muito grande, aguarda-se a separação dos fragmentos maiores na parte superior do gel e não há tanta preocupação com a parte inferior. Neste caso, o corante pode até sair do gel.
O método mais usual para se visualizar o DNA em géis de agarose é por coloração com brometo de etídeo (EtBr) de fórmula C21H2OBrN3. Esse corante se intercala entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz Ultra Violeta (entre 260 e 360nm), fluoresce em vermelho alaranjado (590nm). Com este método pode-se detectar uma quantidade igual ou maior que 10 ng de DNA e a intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra. O brometo de etídeo pode ser utilizado de 3 diferentes formas: aplicado diretamente no gel (uso mais frequente), no tampão da amostra a ser aplicada, ou após a corrida quando o gel é submergido em solução de EtBr.
No entanto, não é recomendada a incorporação do brometo de etídeo no gel porque esse corante interfere no padrão de migração das diversas conformações que a molécula de DNA pode assumir. Segundo, e não menos importante, devido à contaminação da vidraria, da cuba e demais utensílios usados na preparação do gel.
Corantes fluorescentes atóxicos são boas opções alternativas (Yung-Sharp e Kumar, 1989) para visualizar o DNA. Alguns exemplos disponíveis no mercado são: o Azul de Metileno (Flores, et al, 1992), que não apresenta potencial mutagênico e não requer luz U.V, embora apresente a desvantagem de ser pouco sensível; o Sybr Safe®, um corante fluorescente que cora o DNA no gel de agarose e no gel de poliacrilamida exibindo a mesma sensibilidade que o brometo de etídeo e visualizado no transiluminador de luz azul; e o GelRed e o GelGreen que pelo fato de serem termoestáveis podem ser adicionados antes da homogenização do gel.
Os grupos de moléculas de mesmo tamanho que migram na matriz de agarose assumem a forma do poço e constituem as formas chamadas de bandas de DNA. Após a visualização os resultados geralmente são fotodocumentados. No caso de géis corados com brometo de etídio, as fotos devem ser adquiridas sob luz ultravioleta. Para tal, utiliza-se filme Polaroid (branco e preto) ou um software capaz de transformar em imagem a intensidade relativa de fluorescência emitida pelas bandas de DNA captadas por uma câmera fotográfica digital. Em alguns laboratórios, a fim de minimizar os potenciais efeitos danosos da luz ultravioleta, o gel corado com brometo de etídio é colocado dentro de uma câmara e a luz U.V só é ligada com a câmara fechada. Uma câmera acoplada registra a foto do gel.
A mobilidade eletroforética do DNA através do gel de agarose é influenciada por vários fatores que serão discutidos a seguir.
O tamanho dos fragmentos de DNA é o principal fator que influência a migração em gel de agarose. Pode-se dizer que este seria o fator crítico e alvo da análise.
Uma molécula de DNA migra na matriz de agarose com mobilidade inversamente proporcional ao log10 de sua massa molecular, que, por sua vez, é função do tamanho e da forma da molécula. Assim, o tamanho do fragmento do DNA em pares de base, ou seja, sua sequência linear, é o fator que, em princípio, deveria influenciar a migração no gel. Entretanto, nem sempre o DNA encontra-se linear e descondensado e tais fatores podem alterar a migração do fragmento no gel, pois interferem na passagem da molécula de DNA pelos poros.
As moléculas de DNA circular podem assumir formas como: relaxada (com corte, isto é, nick) ou superenovelada (supercoiled). Estas formas não migram de acordo com o tamanho do DNA durante a eletroforese, podendo atravessar a malha do gel em velocidades superiores ou inferiores ao padrão.
No entanto, quando estas moléculas circulares são linearizadas, ou seja são clivadas em um ponto e assumem uma forma linear, então a corrida na eletroforese obedece ao tamanho da molécula. Sob algumas condições, a forma circular superenovada migra mais rapidamente que a forma linear; e sob outras condições acontece o inverso.
Outro exemplo é o DNA genômico, pois sua estrutura condensada e complexa não permite que os fragmentos migrem de acordo com o tamanho em pares de base e sim, fiquem presos nos poros do gel devido à sua estrutura densa e irregular que não permite que os fragmentos atravessem.
Assim, a mobilidade das formas do DNA no gel não depende somente do tamanho da molécula, mas da densidade, torção do DNA e de outros fatores que serão discutidos a seguir.
A concentração da agarose desempenha papel importante na separação eletroforética, pois determina a porosidade do gel, que por sua vez, influencia diretamente na capacidade de migração das moléculas de DNA. Portanto, o tamanho dos poros desta matriz é inversamente proporcional à concentração de agarose utilizada e diretamente proporcional ao tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja separar.
Vale ressaltar que a agarose, apesar de apresentar um custo elevado, pode ser reciclada e reutilizada em eletroforese analítica. Para isso é necessário descontaminá-la dos resíduos de brometo de etídio, equilibrá-la em água, desidratá-la e transformá-la novamente em pó (Reiniger et al, 2004).
A mobilidade dos fragmentos de DNA é influenciada pela presença do brometo de etídeo. O fato desse agente se intercalar entre os pares de bases provoca mudanças na conformação e na flexibilidade da molécula de DNA. Na ausência de brometo as moléculas circulares superenoveladas (forma I) migram mais rápido do que as moléculas lineares (forma III) de mesma massa molecular. Já as moléculas circulares relaxadas (forma II) migram mais lentamente do que as outras duas isoformas topológicas.
Na presença de EtBr os superenovelamentos negativos (geralmente encontrados no DNA de procarioto) são gradualmente removidos, causando a diminuição na mobilidade do DNA. Porém, altas concentrações de brometo acarretam na formação de superenovelamento positivo e conseqüente aumento da mobilidade das moléculas. Além disso, a corrida da forma linear é reduzida em cerca de 15% quando comparada a migração da mesma molécula na ausência do agente intercalante.