Padrão de integração de pAN7-1 em mutantes de Magnaporthe grisea com patogenicidade alterada em arroz
Summa phytopathol. vol.36 no.1 Botucatu Jan./Mar. 2010
https://doi.org/10.1590/S0100-54052010000100003
Carlos Eduardo MarchiI, 1; Sérgio Hermínio BrommonschenkelII; Marisa Vieira de QueirozIII; Mírian de Freitas BorgesI; Eduardo Seiti G. MizubutiII
ILaboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO/SP), Base Física de Jundiaí, SP, CEP 13208-051, Jundiaí, SP
IIDepartamento de Fitopatologia, Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO/SP), Base Física de Jundiaí, SP, CEP 13208-051, Jundiaí, SP
IIIDepartamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa (UFV), CEP 36570-000, Viçosa, MG. Parte da Tese do primeiro autor apresentada a UFV. (2003)
Palavras-chave adicionais: Brusone, genes de patogenicidade, mutagênese insercional, Oryza sativa, Pyricularia grisea, REMI.
Keywords: Rice blast, pathogenicity genes, insertional mutagenesis, Oryza sativa, Pyricularia grisea, REMI.
Programas de mutagênese insercional mediada por transformação têm contribuído grandemente para a prospecção de genes envolvidos na patogenicidade de Magnaporthe grisea (T.T. Hebert) M.E. Barr, o patógeno mais destrutivo da cultura do arroz (Oryza sativa L.). Nos últimos anos, a técnica REMI, Restriction Enzyme-Mediated Integration (16) tem se destacado por potencializar a geração de mutações no genoma do ascomiceto (1, 5, 11, 17, 18, 20). REMI envolve a transformação do organismo com o DNA transformante linear na presença de enzima de restrição, geralmente a mesma utilizada para a linearização do vetor (19). O resultado é a formação de extremidades coesivas compatíveis entre o vetor e o DNA genômico, o que tem aumentado a eficiência de transformação e predominância de integrações simples.
Recentemente, REMI foi adequada para o emprego do vetor pAN7-1 e a enzima HindIII em M. grisea (11). Tal vetor, apesar de amplamente utilizado em outros sistemas, não tem sido explorado para a mutagênese REMI em M. grisea. A análise parcial da coleção dos transformantes resultante, gerada principalmente por REMI, permitiu a identificação de cinco mutantes para a patogenicidade (12). Dois desses mutantes, T93 e T108, causaram poucas lesões em folhas, enquanto o mutante T251 não foi patogênico. O mutante T108, obtido por meio de transformação convencional, adicionalmente, exibiu menor capacidade de desenvolvimento in vitro. Já os mutantes T41 e T72 apresentaram agressividade reduzida e maior período de incubação, respectivamente. Atraso considerável na germinação de conídios e formação de apressórios também foi verificado em T72 (12).
O objetivo deste trabalho foi verificar a presença do vetor de transformação no genoma de quatro dos mutantes de M. grisea supracitados (T41, T93, T108 e T251), analisando o número de cópias e sítios de integração de pAN7-1.
Mutantes de Magnaporthe grisea I-22 e condições de cultivo
Foram analisados os mutantes para a patogenicidade alterada em arroz gerados por Marchi et al. (12), especificamente T41, T93, T108 e T251. Enquanto os mutantes T93 e T251 foram obtidos por meio de integração de pAN7-1 mediada por 50 U e 30 U de HindIII, respectivamente, T108 foi gerado por transformação convencional (integração não mediada por enzima de restrição), utilizando o vetor linearizado. Por sua vez, a mutação insercional em T41 foi gerada sem a adição de HindIII à reação de transformação, porém, foi favorecida pela atividade residual da enzima utilizada para a linearização do vetor (11, 12). O isolado selvagem I-22, patogênico a plantas de arroz, cedido pelo Laboratório de Fitopatologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, foi utilizado como controle.
Rotineiramente, o fungo foi cultivado em meio de farinha de arroz-ágar (FAA - 20 g de farinha de arroz com casca, 5 g de sacarose, 15 g de ágar, 1 L de água destilada) por cinco a sete dias, em BOD a 28ºC no escuro. No caso dos mutantes, foram adicionados 100 mg de higromicina/mL no meio FAA. Para a preservação do fungo em longo prazo, pedaços (4 cm2) de papel manteiga colonizados pelo micélio foram mantidos a - 80ºC (21).
O fungo foi cultivado em meio completo (0,5% de sacarose, 0,3% de extrato de levedura, 0,3% de caseína hidrolisada), sob agitação (130 - 150 rpm) durante 10 - 14 dias a 28ºC, no escuro. As extrações de DNA foram realizadas conforme Scheuermann (15). Brevemente, o micélio, uma vez seco e macerado em nitrogênio líquido, foi transferido para tubo de microcentrífuga e misturado com 750 mL de tampão de extração (CTAB a 55 mM, Tris a 100 mM, pH 8,0, EDTA a 10 mM, NaCl a 0,7 M) e 15 mL de mercaptoetanol. Após incubação a 65ºC por 30 minutos, foram acrescentados 500 mL de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1) e a mistura foi centrifugada por cinco minutos a 14.000 rpm. A fase aquosa superior foi transferida para outro microtubo, adicionados 500 mL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), e a mistura foi centrifugada novamente. A fase líquida foi transferida para microtubo contendo 750 mL de isopropanol (- 20ºC), incubada em gelo por 10 minutos e centrifugada. Por fim, o precipitado foi lavado duas vezes com 1 mL de etanol 70% (- 20ºC), seco e ressuspendido em 50 mL de tampão TE (Tris a 10 mM, pH 8,0, EDTA a 1 mM). A concentração do DNA foi estimada por comparação com padrões de DNA. As amostras de DNA foram armazenadas a - 20ºC.
Para verificar a presença de pAN7-1 no genoma dos mutantes de M. grisea I-22 que apresentaram patogenicidade alterada ao arroz, PCR foi conduzida com os oligonucleotídeos hph1 e hph2, que anelam especificamente na região estrutural do gene HPH, utilizado como marcador de seleção. Após a extração, o DNA total foi submetido à amplificação utilizando os oligonucleotídeos específicos hph1 (CAGCGAGAGCCTGACCTATTGC) e hph2 (GCCATCGGTCCAGACGGCCGCGC). O programa de amplificação consistiu de um ciclo de desnaturação de dois minutos a 95ºC, seguido por 30 ciclos com um minuto de desnaturação (92ºC), 60 segundos para o anelamento dos oligonucleotídeos a 60ºC, e 90 segundos de polimerização a 72ºC. Os amplicons foram visualizados em gel de agarose a 1,4%.
Análise de Southern blot
Aproximadamente 2,5 mg de DNA do indivíduo selvagem e dos mutantes selecionados foram digeridos com a enzima HindIII, ClaI ou EcoRV. Os fragmentos de digestão foram fracionados em um gel de agarose a 0,8% e transferidos para membrana de náilon (Stratagene® ou Hybond-N) de acordo com Sambrook et al. (13). A marcação da sonda (pAN7-1), hibridização e detecção do sinal foram realizadas com o Gene Images Random-Prime Labelling Module Kit e CPD-Star Detection Module (Amersham), segundo as instruções dos fabricantes. Para a marcação da sonda com a-32P-CTP utilizou-se o sistema Rediprime II (Amersham), conforme instruções do fabricante.
A integração de pAN7-1 no genoma dos mutantes para a patogenicidade alterada em arroz (T41, T93, T108 e T251) foi confirmada pela reação de PCR (Figura 1). As reações positivas foram caracterizadas pela amplificação de fragmentos de DNA com 690 pb, correspondentes à presença do gene de seleção HPH.
A confirmação da presença de pAN7-1 no genoma dos mutantes, contudo, não garante que as alterações para a patogenicidade em arroz, identificadas nos mesmos por Marchi et al. (12), foram resultantes do evento de integração do vetor. Com respeito a REMI, embora eficiente no estudo da patogenicidade fúngica, tem sido significativa a taxa de mutações não marcadas fisicamente (deleções e rearranjamento de DNA genômico), as quais podem ser geradas espontaneamente ou pelo reparo do DNA induzido pela técnica (10). Em M. grisea, Sweigard et al. (20) obtiveram cerca de 1/3 de mutantes REMI não marcados pela presença do vetor de transformação, em alguns casos envolvendo grandes deleções de DNA.
A correlação entre o fenótipo mutante e a inserção do vetor pode ser verificada por meio da clonagem da sequência interrompida pelo DNA transformante, a qual é posteriormente utilizada para restaurar o fenótipo selvagem. Para isso, inicialmente foram conduzidas análises de Southern blot para determinar o padrão de integração de pAN7-1 no genoma dos mutantes T41, T93, T108 e T251, as quais subsidiarão os trabalhos de clonagem.
O uso de ClaI ou EcoRV, enzimas que não possuem sítios de restrição no vetor, permitiu detectar o número de sítios de integração no DNA genômico. Pela clivagem do DNA não ocorrer na sequência de pAN7-1, foram esperados fragmentos com homologia ao vetor superiores a 6,75 Kb (tamanho de pAN7-1). Para cada mutante, as hibridizações realizadas com DNA-ClaI e DNA-EcoRV apresentaram similaridades entre os padrões de integração do vetor (Figura 2).
A clivagem do DNA dos mutantes com HindIII, a enzima usada em REMI, permitiu determinar a ocorrência de integrações múltiplas cópias (in tandem), bem como dos eventos REMI propriamente ditos. Tais eventos foram detectados pela presença de fragmentos com homologia a pAN7-1 com tamanho igual a 6,75 Kb, indicando a restauração dos sítios de restrição. De acordo com esta análise, constataram-se diferenças no padrão de integração do vetor no genoma dos mutantes T41, T93, T108 e T251 (Figura 3).
Quando o DNA de T41 foi clivado com ClaI ou EcoRV, foi possível verificar que pAN7-1 integrou-se em dois sítios no genoma do fungo (Figura 2, linha 1). A análise conduzida com HindIII revelou dois fragmentos com homologia a pAN7-1, com tamanhos superiores a 6,75 Kb (Figura 3, linha 1). As análises de Southern blot indicaram tratar-se de duas integrações do tipo única cópia, as quais não apresentaram a restauração de todos os sítios de restrição HindIII pelo sistema de reparo de DNA da célula.
O T93 foi o mutante que apresentou padrão de integração de pAN7-1 mais complexo. Também foram detectados dois sítios de inserção do vetor no DNA genômico, identificados pela presença de dois fragmentos com homologia a pAN7-1 (Figura 2, linha 2). Quando a hibridização foi conduzida com o DNA de T93 clivado com HindIII, foram visualizados quatro fragmentos, um dos quais com 6,75 Kb (Figura 3, linha 2). Os resultados sugeriram que, nesse mutante, uma das integrações de pAN7-1 no genoma foi do tipo in tandem (fragmento maior, com sinal mais intenso) (Figura 2, linha 2). Em alguns sistemas, REMI tem induzido frequência considerável de integrações do vetor in tandem. Shi et al. (18), por exemplo, observaram tais eventos em 5% dos transformantes REMI de M. grisea. As inserções do tipo in tandem podem ser geradas pela formação de concatâmeros do vetor priori à transformação ou por repetidos ciclos de recombinação homóloga após inserção do DNA transformante no genoma fúngico (3). Para Penicillium paxilli Bainier, a defosforilação de pAN7-1, para prevenir a formação de concatâmeros, não reduziu a frequência de integrações in tandem, sugerindo que, para algumas espécies fúngicas, predominam os eventos de recombinação homóloga entre cópias do vetor (7).
As análises de Southern blot conduzidas com ClaI ou EcoRV revelaram a presença de apenas um fragmento com homologia a pAN7-1 no genoma de T108, indicando um único sítio de integração do vetor (Figura 2, linha 3). A hibridização realizada com o DNA-HindIII desse mutante também resultou na presença de apenas um fragmento com homologia ao vetor (Figura 3, linha 3), de tamanho superior a 6,75 Kb. Os resultados permitiram inferir que, nesse mutante, apenas uma cópia de pAN7-1 integrou-se em um único sítio no DNA fúngico, muito provavelmente, fora de um sítio de restrição HindIII, visto que T108 originou-se de transformação convencional.
O mutante T251 também apresentou apenas um único fragmento com homologia ao vetor, independente da análise de Southern blot (Figuras 2 e 3, linha 4), ou seja, apresentou apenas uma cópia de pAN7-1 integrada em um único sítio no DNA fúngico. Contudo, o fragmento com homologia a pAN7-1 detectado com o DNA-HindIII apresentou tamanho igual ao de pAN7-1 (Figura 3, linha 4). Esse padrão de integração foi o único a sugerir a ocorrência de restauração dos sítios de restrição de HindIII, ou seja, evento REMI. Indivíduos com o padrão de integração semelhante à T251 foram previamente considerados ideais para a clonagem de genes via recuperação do vetor (9, 14, 16).
REMI é preconizada como uma técnica que favorece os eventos de integração do vetor em único sítio do genoma, sobretudo na forma de cópia única. Dos três mutantes REMI, apenas T251 apresentou uma simples cópia de pAN7-1 integrada em um único sítio no genoma de I-22 (Figura 2, linhas 1, 2 e 4). Contudo, índices superiores já foram constatados para M. grisea (18). Por outro lado, as análises de Southern blot conduzidas com os mutantes REMI exibiram diferenças quanto ao tamanho dos fragmentos com homologia a pAN7-1, o que refletiu a possível aleatoriedade dos eventos de integração.
Esforços iniciais para isolar as sequências inativadas, usando o protocolo de Kuspa & Loomis (8), não foram bem sucedidos. As colônias de Escherichia coli T. Escherich (linhagem DH5-a) continham apenas o vetor pAN7-1 vazio (sem as seqüências genômicas flanqueadoras) ou um plasmídeo de tamanho menor, com deleção do fragmento EcoRI (dados não apresentados). Bölker et al. (2) enfrentaram problemas semelhantes na recuperação do vetor pSMUT do genoma de Ustilago maydis (DC.) Corda. Para este caso, os autores atribuíram a causa do fenômeno à recombinação dentro de fragmentos contendo cópias múltiplas do vetor. Ensaios de recuperação do vetor deverão ser conduzidos com outras bactérias e outras enzimas. Pelo menos para T251, que apresentou evento REMI, a recuperação da sequência inativada poderá ser efetuada com PCR invertida (4), utilizando oligonucleotídeos que anelam nas extremidades de pAN7-1.
O padrão de integração do vetor nos mutantes REMI, caracterizado pelo baixo número de cópias no genoma e a aleatoriedade dos eventos de inserção, aliado à eficiência de transformação obtida por Marchi et al. (11), indicaram o potencial de REMI para a mutagênese insercional de M. grisea quando conduzida com pAN7-1 e HindIII. Programas de mutagênese REMI, conduzidos com as características supracitadas, constituem ferramenta importante para a prospecção dos genes de M. grisea envolvidos na patogenicidade em arroz, cuja compreensão é fundamental para o estabelecimento de estratégias eficientes de manejo da doença.
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