Bolsa 08/11590-5 - Chaperonas moleculares, Saccharomyces cerevisiae - BV FAPESP
Estudo de Interações Protéicas da Tiorredoxina Peroxidase Nuclear (nTPx) de Saccha...
Estudo de relações moleculares de tpxi-trxii de saccharomyces cerevisiae através d...
Mutagênese sítio dirigida, expressão, purificação e obtenção de complexos protéico...
Regulação da expressão, estrutura e função de cTpxI e cTpxIII, duas enzimas antiox...
Análise funcional e estrutural de proteínas antioxidantes dependentes de tióis: um...
Investigação comparativa de interações moleculares das tiorredoxinas peroxidase citosólicas I e III (cTPxI e cTPxIII) de Saccharomyces cerevisiae envolvidas na proteção celular e transdução de sinal em resposta ao H2O2 e choques térmicos
Processo: 08/11590-5
Beneficiário: Luana Martins de Andrade da Cruz
Assunto(s): Chaperonas moleculares Saccharomyces cerevisiae Crescimento celular
A geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) é um fenômeno biológico comum na vida das células eucarióticas. Para prevenir ou combater os danos causados pelas EROs, as células desenvolveram diferentes sistemas protetores e reparadores. O sistema antioxidante enzimático é um dos principais meios de remoção de EROs formadas durante o metabolismo intracelular. Dentre as enzimas envolvidas na remoção de oxidantes, as tiorredoxinas peroxidases (Tpx) têm sido intensamente usadas graças a sua grande representação e conservação nos mais diferentes organismos e sua larga distribuição nos compartimentos celulares. Em Saccharomyces cerevisiae, um organismo modelo para estudos bioquímicos e genéticos de eucariotos, já foram descritas cinco isoformas de tiorredoxinas peroxidases, as citossólicas (cTpxI, cTpxII e cTpxIII), a mitocondrial (mTpx) e a nuclear (nTpx). Em adição à atividade peroxidásica, algumas tiorredoxinas peroxidases de S. cerevisiae possuem atividade de chaperona molecular, detectada somente para cTpxI e cTpxII, sendo ativada em condições de estresse oxidativo e/ou de choque térmico. A atividade chaperona de cTpxI e cTpxII foi de 3 a 15 vezes mais eficiente do que a atividade de chaperonas bem estudadas como ±-cristalina e HSP16.5. Esta atividade destas proteínas parece ser bem importante uma vez que estudos recentes demonstram a associação de cTpxI com os ribossomos Apesar de não ter atividade de chaperona alguns trabalhos também apontam a associação de cTpxIII com elementos do complexo HSP70, o que evidencia a importância destas proteínas na proteção celular. Adicionalmente, apesar dos peróxidos serem classicamente considerados como agentes deletérios, diversos trabalhos recentes têm demonstrado o envolvimento do H2O2, em baixas concentrações, em eventos de transdução de sinal. Células de eucariotos produzem H2O2 para mediar diversas respostas fisiológicas, como a proliferação, diferenciação e migração celular. Este H2O2 produzido em resposta a estes estímulos tem sido reconhecido como um importante mensageiro intracelular que modifica a função enzimática de diversas proteínas através da oxidação de resíduos de aminoácidos, em especial cisteínas. Trabalhos recentes apontam grande importância das Tpx também em processos de sinalização celular seja através da modulação dos níveis endógenos de H2O2 ou por meio do estabelecimento de dissulfetos mistos com MAP quinases. Entretanto, até o momento pouco se sabe sobre o estabelecimento e manutenção de dissulfetos mistos entre Tpx e outras proteínas celulares. Este projeto tem como objetivo determinar novos parceiros biológicos in vitro e in vivo em respostas aos aumentos dos níveis de H2O2 de Tpxs através de proteínas selvagens e mutantes carreando substituições de CysR por serinas (cTpxI C170Se , cTpxIII C119S), em fusão com diferentes tags expressas em bactérias ou em linhagens mutantes da respectiva Tpx. A identificação será efetuada por meio da metodologia de co-purificação, ensaios de pull down e separação dos complexos por PAGE nativo e cromatografias de exclusão molecular aliado a espectrometria de massas (LC/MS/MS). A confirmação dos alvos identificados será efetuada através de ensaios de duplo híbrido contendo as Tpxs selvagens e mutantes e os respectivos parceiros biológicos. Acreditamos que os resultados deste trabalho podem contribuir de forma significativa para o entendimento das relações das Tpx nos diversos eventos relacionados a proteção celular em resposta aos estresses oxidativos e térmicos e sua participação em eventos de sinalização. Uma vez que as Tpx de S. cerevisiae possuem ortólogos em mamíferos, em especial no homem, os resultados obtidos poderão contribuir para um melhor entendimento de processos deletérios e doenças genéticas envolvendo agregação e crescimento celular desordenado como o mal de Alzheimer e câncer. (AU)