Nascido em Lisboa, era filho do rei Manuel I de Portugal e de Maria de Aragão, princesa de Espanha, filha dos Reis Católicos. Na câmara da Rainha, parturiente, Gil Vicente em trajes de vaqueiro representou sua primeira peça, o Auto da Visitação ou Monólogo do Vaqueiro. O batismo em 15 de junho foi realizado na capela de São Miguel do Paço da Alcáçova, tendo como padrinho o doge de Veneza, Leonardo Loredan, representado por Pero Pasquaglio. Foram madrinhas uma tia paterna, a Rainha Dona Leonor, viúva de Dom João II, e a avó paterna, a infanta Dona Beatriz, duquesa de Beja. Nas Cortes a seguir convocadas para 15 de agosto, o príncipe foi jurado herdeiro.