Auxílio à pesquisa 09/08210-9 - Biologia celular, Análise de sequência de DNA - BV FAPESP
Aspectos moleculares e celulares de glandulas salivares de rhynchosciara americana...
Processo: 09/08210-9
Assunto(s): Biologia celular Análise de sequência de DNA NADPH oxidase Apoptose Transcrição genética Insetos Larva Biblioteca gênica
Visando uma estratégia solidária este projeto reúne três grupos de pesquisa trabalhando em diferentes modelos biológicos para viabilizar procedimentos de seqüenciamento de DNA. Esta medida visa: facilitar a interação entre nossos grupos, possibilitando a cooperação ativa e a construção de novas idéias integradoras futuras; favorece a exploração de novas possibilidades de trabalho o que aumenta a possível abrangência de nossos resultados; propõe atividades técnicas conjuntas entre nossos estudantes e técnicos, otimizando assim conhecimento e praticidade de execução de tarefas, além da óbvia redução de custos e amplia o repertório de experiências, estimulando o amadurecimento e o desenvolvimento global dos integrantes dos grupos ao mesmo tempo em que reduz o tempo de independência e de aquisição de habilidades ferramentais. Neste contexto e utilizando principalmente o seqüenciamento de DNA, este projeto pretende: 1. Clonar e caracterizar o cDNA das subunidades gp91, p22phox, p40phox, p67phox e p47phox da NAD(P)H oxidase das células trofoblásticas de camundongo durante a fase de implantação embrionária e analisar comparativamente as sequências obtidas com as seqüência da NADPH-oxidase fagocítica, envolvida com processos de defesa orgânica, o que poderá ser de extrema valia na compreensão dos mecanismos específicos associados à barreira placentária e na defesa do embrião-feto (subprojeto 1); 2. Caracterizar mensagens associadas ao processo de metamorfose larval de Rhynchosciara americana enfocando principalmente o processo de morte celular programada que ocorre na glândula salivar deste díptero. Este procedimento incluirá a construção de uma biblioteca subtrativa de cDNAs de glândulas salivares de larvas em desenvolvimento (2º período e pré-pupas), seu conseqüente seqüenciamento e caracterização. Os genes de interesse terão seus perfis de expressão determinados e quantificados por Real Time PCR nas células do corpo gorduroso, órgão que durante a metamorfose sobre modificação na forma e funções e que persiste na mosca adulta. Estes serão também localizados nos cromossomos através de hibridizações in situ. (subprojeto 2); 3. Sequenciar clones de transcriptomas, a partir de RNA de ovários de rainhas (possibilitando a identificação de mensagens maternas nos ovos e envolvidas no desenvolvimento embrionário) e de RNA de uma mistura de corpo gorduroso, hemolinfa, Malpighi, gânglios nervosos, glândulas e músculo de diversas castas (para a identificação de mensagens envolvidas em diferentes processos biológicos, tais como defesa, comportamento e comunicação). A expectativa desta proposta é de identificar a maior quantidade possível de transcritos. Utilizando mensageiros originados de diferentes tecidos e de diferentes castas pode-se viabilizar em um futuro a curto e médio prazo experimentos de "microarray", SAGE, RACE e RT-PCR. Este subprojeto pretende também construir uma biblioteca genômica com insertos de alto peso molecular clonados em BACs a partir de DNA genômico mecanicamente fragmentado. Tal biblioteca devidamente construída e armazenada pode virtualmente representar redundantemente todo o genoma de Atta. Outros possíveis frutos destas abordagens seria a viabilidade de experimentos de genômica comparativa, a geração de um mapa citogenético de alta resolução a partir de "fingerprints" e hibridizações in situ de clones específicos, bem como seria importante para o fechamento de "Gaps" em uma iniciativa de seqüenciamento em larga escala. Esta biblioteca de alto peso molecular (BAC) e a confecção destas membranas voltadas a varreduras permanecerão à disposição de qualquer pesquisador com interesse no modelo. (AU)