Análise TG-ROC de testes de imunofluorescência no diagnóstico de leishmaniose visceral canina
http://dx.doi.org/10.1590/S0034-89102009005000063
Análisis TG-ROC de pruebas de inmunofluorescencia en el diagnóstico de leishmaniasis visceral canina
Rita Maria da SilvaI; Márcia Dalastra LaurentiII; Almério de Castro GomesIII; Yeda Lopes NogueiraIV
ISeção de Parasitologia. Divisão de Laboratórios Regionais. Instituto Adolfo Lutz. Rio Claro, SP, Brasil
IIDepartamento de Patologia. Faculdade de Medicina. Universidade São Paulo (USP). São Paulo, SP, Brasil
IVSeção de Sorologia. Divisão de Biologia Médica. Instituto Adolfo Lutz. São Paulo, SP, Brasil
OBJETIVO: Analisar a acurácia do diagnóstico de dois protocolos de imunofluorescência indireta para leishmaniose visceral canina.
MÉTODOS: Cães provenientes de inquérito soroepidemiológico realizado em área endêmica nos municípios de Araçatuba e de Andradina, na região noroeste do estado de São Paulo, em 2003, e área não endêmica da região metropolitana de São Paulo, foram utilizados para avaliar comparativamente dois protocolos da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para leishmaniose: um utilizando antígeno heterólogo Leishmania major (RIFI-BM) e outro utilizando antígeno homólogo Leishmania chagasi (RIFI-CH). Para estimar acurácia utilizou-se a análise two-graph receiver operating characteristic (TG-ROC). A análise TG-ROC comparou as leituras da diluição 1:20 do antígeno homólogo (RIFI-CH), consideradas como teste referência, com as diluições da RIFI-BM (antígeno heterólogo).
RESULTADOS: A diluição 1:20 do teste RIFI-CH apresentou o melhor coeficiente de contingência (0,755) e a maior força de associação entre as duas variáveis estudadas (qui-quadrado=124,3), sendo considerada a diluição-referência do teste nas comparações com as diferentes diluições do teste RIFI-BM. Os melhores resultados do RIFI-BM foram obtidos na diluição 1:40, com melhor coeficiente de contingência (0,680) e maior força de associação (qui-quadrado=80,8). Com a mudança do ponto de corte sugerido nesta análise para a diluição 1:40 da RIFI-BM, o valor do parâmetro especificidade aumentou de 57,5% para 97,7%, embora a diluição 1:80 tivesse apresentado a melhor estimativa para sensibilidade (80,2%) com o novo ponto de corte.
CONCLUSÕES: A análise TG-ROC pode fornecer importantes informações sobre os testes de diagnósticos, além de apresentar sugestões sobre pontos de cortes que podem melhorar as estimativas de sensibilidade e especificidade do teste, e avaliá-los a luz do melhor custo-benefício.
Descritores: Leishmaniose Visceral, diagnóstico. Cães. Imunofluorescência. Técnicas de Diagnóstico e Procedimentos. Sensibilidade e Especificidade. Estudos Soroepidemiológicos.
OBJETIVO: Analizar la precisión de diagnóstico de dos protocolos de inmunofluorescencia indirecta para leishmaniasis visceral canina.
MÉTODOS: Canes provenientes de pesquisa seroepidemiológico realizado en área endémica en los municipios de Araçatuba y de Andradina, en la región noroeste del estado de Sao Paulo (Brasil), en 2003, y área no endémica de la región metropolitana de Sao Paulo, fueron utilizados para evaluar comparativamente dos protocolos de reacción de inmunofluorescencia indirecta (RIFI) para leishmaniasis: uno utilizando antígeno heterólogo Leishmania major (RIFI-BM) y otro utilizando antígeno homólogo Leishmania chagasi (RIFI-CH). Para estimar precisión se utilizó el análisis two-graph receiver operating characteristic (TG-ROC). El análisis TG-ROC comparó las lecturas de la dilución 1:20 del antígeno homólogo (RIFI-CH), consideradas como pruebas referencia, con las diluciones de la RIFI-BM (antígeno heterólogo).
RESULTADOS: La dilución 1:20 de la prueba RIFI-CH presentó mejor coeficiente de contingencia (0,755) y la mayor fuerza de asociación entre las dos variables estudiadas (Chi-cuadrado=124,3), siendo considerada la dilución-referencia de la prueba en las comparaciones con las diferentes diluciones de la prueba RIFI-BM. Los mejores resultados del RIFI-BM fueron obtenidos en la dilución 1:40, con mejor coeficiente de contingencia (0,680) y mayor fuerza de asociación (Chi-cuadrado= 80,8). Con el cambio del punto de corte sugerido en este análisis para la dilución 1:40 de la RIFI-BM, el valor del parámetro especificidad aumentó de 57,5% a 97,7%, a pesar de que la dilución 1:80 haya presentado la mejor estimativa para sensibilidad (80,2%) con el nuevo punto de corte.
CONCLUSIONES: El análisis TG-ROC puede suministrar importantes informaciones sobre las pruebas de diagnóstico, así como presentar sugerencias sobre puntos de cortes que pueden mejorar las estimativas de sensibilidad y especificidad de la prueba, y evaluarlos a la luz del mejor costo-beneficio.
Palabras llave: Leishmaniasis Visceral, diagnóstico. Perros. Técnica del Anticuerpo Fluorescente. Técnicas y Procedimientos Diagnósticos. Sensibilidad y Especificidad. Estudios Seroepidemiológicos.
A leishmaniose visceral americana (LVA) atinge 88 países, dos quais 90% dos casos ocorrem na Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil.ª
No Brasil, a LVA é considerada endêmica em 19 estados, principalmente na região Nordeste, onde ocorre notificação de maior número de casos e tem apresentado mudanças no padrão de transmissão.
Inicialmente, considerada doença predominante em ambientes rurais e periurbanos, hoje tem sido registrada em grandes centros urbanos como Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Corumbá (MS).10,b,c
No estado de São Paulo, o primeiro relato de autoctonia da doença humana foi registrado na região metropolitana de São Paulo, em 1978.10 Todavia, na época, não foi possível identificar reservatório e vetor nos elos da cadeia de transmissão. Em 1998, no município de Araçatuba, foi detectada a presença de Leishmania sp. em exame parasitológico direto de cães com suspeita clínica de leishmaniose visceral canina (LVC), sendo posteriormente identificada como Leishmania chagasi. Estes fatos, aliados à presença do inseto transmissor, Lutzomyia longipalpis, notificada em 1997, confirmaram a autoctonia de LVC em cães na área urbana de Araçatuba. Em 1999, no mesmo município, foi relatado o primeiro caso humano autóctone neste município.b
Em geral, os programas oficiais de vigilância e controle de LVC preconizam a realização de inquéritos sorológicos caninos visando conhecer a situação epidemiológica da doença nas áreas com transmissão ativa ou com potencial de transmissão e simultaneamente à identificação dos cães sorologicamente positivos para posterior eliminação.b,c Estudos enfatizam a importância dos parâmetros de sensibilidade e especificidade dos testes quando avaliam o impacto da eliminação do cão frente à metodologia sorológica empregada.3 Pesquisas que avaliaram os resultados obtidos nos inquéritos epidemiológicos realizados em Belo Horizonte1,2 utilizando kit feito com o antígeno de Leishmania major, sugerem que a utilização da reação de imunofluorescência indireta (RIFI) poderia comprometer a efetividade do Programa de Controle da LVC por não estar detectando animais infectados, em virtude dos resultados falsos negativos, e ao mesmo tempo, identificando cães não infectados (falsos positivos) com conseqüente recomendação de sua eliminação, de acordo com o Programa de Controle da doença.
O presente estudo teve por objetivo analisar a acurácia de dois protocolos da reação de imunofluorescência indireta para leishmaniose visceral canina.
Os testes foram realizados em dois grupos de amostras.
O grupo A foi constituído por 94 amostras de soros de cães machos e fêmeas de idades e raças diversas, das quais 74 eram provenientes de inquérito soro-epidemiológico realizado nos municípios de Araçatuba e de Andradina, área endêmica da região noroeste do estado de São Paulo.
Foram acrescentadas 20 amostras de soros de cães negativos provenientes do município de São Paulo, uma área considerada sem transmissão, na época da coleta (2003).
Todos os cães foram avaliados quanto ao estado clínico, além de terem sido avaliados sorologicamente para o diagnóstico de LVC pela RIFI e por exame parasitológico direto. Desta forma, os cães do grupo A foram considerados como população referência, dos quais 50 apresentaram diagnósticos positivos classificados clinicamente como: sintomáticos (30 cães), oligossintomáticos (18 cães) e assintomáticos (dois cães). Havia 24 animais com diagnóstico negativo pertencentes à área endêmica e 20 provenientes de área considerada não endêmica.
O grupo B foi constituído por 160 amostras pareadas de soro e sangue, colhidas em papel filtro, de cães provenientes dos mesmos municípios e que participaram de inquéritos sorológicos para LVA.
Foram comparados dois testes de RIFI: um utilizando formas promastigotas de Leishmania major (antígeno heterólogo), (RIFI-BM, Biomanguinhos, Fiocruz), e o outro formas promatigotas de Leishmania chagasi (antígeno homólogo), (RIFI-CH, Laboratório de Patologia de Doenças Infecciosas, Faculdade de Medicina da USP). Em ambos os testes, as amostras foram avaliadas semi-quantitavamente, nas diluições 1:20, 1:40, 1:80 e 1:160. Os testes foram realizados em duplicata e as amostras foram re-numeradas, de modo que as leituras fossem feitas como um teste cego.
As leituras da RIFI foram realizadas em microscópio de fluorescência com aumento de 400 vezes, sendo o critério de leitura adotado de acordo com a densidade de parasitos fluorescentes e definido em número de cruzes: 1+ , 2+, 3+ e 4+, formando um escore. Este escore foi transformado em percentagens, para que a variável quantitativa se transformasse em contínua, possibilitando utilizar a técnica Two-Graph Receiving Operator Caracteristics (TG-ROC).7 A leitura realizada com a RIFI-CH serviu de parâmetro de comparação: como regra geral, o campo visual do microscópio foi dividido em quatro quadrantes, cada quadrante preenchido com parasitos fluorescentes equivalendo a 25% de fluorescência ou 1+.d
Para cada conjunto de resultados obtidos nas leituras dos testes RIFI-BM e RIFI-CH foram feitas análises sobre a distribuição de freqüências para cada diluição dos soros versus as formas clínicas, calculado o qui-quadrado e os coeficientes de contingências extraídos das tabelas de contingências. Para esta análise utilizou-se o pacote estatístico Medcalc.e
As estimativas dos pontos de cortes, bem como os parâmetros de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo e eficiência foram obtidos por meio da análise gráfica gerada pela técnica TG-ROC7 do pacote estatístico CMDT.8
Observa-se leituras da RIFI-CH e RIFI-BMd que com o antígeno homólogo da RIFI-CH, a reação de imunofluorescência é mais específica que a RIFI com antígeno heterólogo (RIFI-BM), a qual apresenta uma reação de fundo inespecífica, que muitas vezes prejudica a leitura correta.
Os resultados expressos nas Tabelas 1 e 2, referentes às amostras do grupo A mostram as distribuições, nos dois testes (RIFI-CH e RIFI-BM) das leituras nas diferentes categorias, da variável diagnóstico clínico versus a variável diluição dos soros.
Do total de amostras analisadas de 94 soros do grupo A, quando comparados os resultados dos dois testes observou-se que no grupo dos verdadeiros negativos (clinicamente classificados como sadios) 95,4% (42/44) foram não-reagentes pela RIFI-CH, nas diluições 1:20, 1:40 e 1:80 e 90,9% (40/44) na diluição 1:160 (Tabela 1). Já para o teste RIFI-BM, os resultados não-reagentes foram: 36,3% (16/44) na diluição 1:20, 50,0% (22/44) na diluição 1:40, 56,8% (25/44) na diluição 1:80 e 52,2% (23/41) na diluição 1:160 (Tabela 2). Observou-se também que não houve correlação específica entre os diferentes estágios da doença e os diferentes graus de fluorescência da leitura da reação, pois todas as formas clínicas distribuíram-se em todas as faixas de leitura, variando de < 25% (fracamente positiva) a 3+ (75%).
A diluição 1:20 do teste RIFI-CH (Tabela 1) apresentou o melhor coeficiente de contingência (0,755) e a maior força de associação entre as duas variáveis estudadas (qui-quadrado = 124,3), sendo considerada a diluição-referência do teste e utilizada para o estudo comparativo com as diferentes diluições do teste de RIFI-BM. Para este teste os melhores resultados foram obtidos na diluição 1:40, que apresentou o melhor coeficiente de contingência (0,680) e a maior força de associação (qui-quadrado=80,8) (Tabela 2).
Na análise gráfica TG-ROC da Figura 1 observam-se os valores dos parâmetros de sensibilidade e especificidade, representados no eixo y, enquanto que no eixo x estão os valores das leituras realizadas em cruzes, as quais foram transformadas em percentagens (valores dos pontos de corte). A análise gráfica TG-ROC compara as leituras da diluição 1:20 do antígeno homólogo (RIFI-CH), consideradas como teste- referência, com as leituras de cada uma das diluições (1:20, 1:40, 1:80 e 1:160) da RIFI-BM (antígeno heterólogo) (Figura 1).
A Figura 1 foi construída aplicando-se o valor do novo ponto de corte da diluição 1:40 (Figura 1B) estabelecido pela análise TG-ROC do grupo A na população canina do grupo B. As 160 amostras pareadas de soro e de sangue colhidas em papel filtro já haviam sido avaliadas na diluição 1:40, uma vez que esta diluição é a recomendada pela bula do kit RIFI-BM. Todavia, nessa mesma diluição, não foram considerados positivos os resultados com reação de fluorescência que apresentasse 1+ ou 25% de fluorescência, pois o ponto de corte considerado foi igual 26,70%, portanto >25%. Na Figura 2A, as estimativas dos parâmetros de sensibilidade e especificidade foram 98% e o novo valor do ponto de corte foi 39,5%. O mesmo procedimento em relação ao ponto de corte foi realizado com os mesmos cães, cujo sangue foi colhido em papel filtro e os valores de sensibilidade e especificidade foram 73% e novo valor do ponto de corte igual a 37,2% (Figura 2B).
A Tabela 3 mostra as novas estimativas dos parâmetros de sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo e negativo, eficiência e classificação incorreta para a RIFI-BM, tomando-se como base o ponto de corte fornecido na análise TG-ROC e tendo como referência a diluição 1:20 do teste RIFI-CH. Os novos pontos de corte apresentados na Figura 1 resultaram em novos valores para parâmetros de sensibilidade e especificidade.
A análise gráfica TG-ROC7 permite encontrar o valor do ponto de corte associado com a combinação dos parâmetros de sensibilidade e especificidade. Desta forma, a acurácia do teste de diagnóstico permite discriminar indivíduos doentes de não doentes (sadios).
No presente trabalho, aplicou-se a análise gráfica TG-ROC na população do grupo A comparando dois testes diagnósticos, um específico, RIFI-CH, utilizando antígeno homólogo e outro feito com antígeno heterólogo, RIFI-BM. Observamos que a melhor separação entre cães com sorologia negativa (sadios) e com sorologia positiva (possivelmente doentes) foi com a diluição 1:20 do teste RIF-CH, que apresentou melhor coeficiente de contingência e qui-quadrado (Tabela 1), enquanto que para o teste RIFI-BM foi a diluição 1:40 que melhor separou as duas sub-populações (Tabela 2).
Desta forma, o novo ponto de corte sugerido nas diluições 1:20 e 1:40 da RIFI-BM (Figura 1), acima de 25% (1+), exclui os resultados 1+ como positivo, resultando em caráter negativo. Neste caso, com a população do grupo A, quando se analisam os resultados dos referidos testes comparativamente, sem o ajuste do ponto de corte, observa-se significativa diferença entre eles. Isto pode ser explicado pelas características dos casos próximos ao ponto de corte, que geralmente possuem baixos títulos de anticorpos e é a faixa na qual geralmente, a reatividade cruzada é observada. Estudos que avaliaram o teste imunoenzimático (ELISA) empregando diferentes extratos antigênicos e com cães de área endêmica para LVC observaram a existência de reações cruzadas com outras doenças parasitárias (doença de Chagas, dirofilariose e babesiose), tanto com antígeno homólogo de L. chagasi como com antígeno heterólogo de L. amazonensis, ao passo que quando utilizaram os antígenos recombinantes rk-39 e rk-26, não foi observada nenhuma reatividade cruzada.15 Outro trabalho5 mostrou a ocorrência de reações cruzadas ao comparar três métodos sorológicos para LVC: RIFI, ELISA e direct aglutination test (DAT). Após analisadas 234 amostras de cães de uma área endêmica de Minas Gerais, os índices de especificidade para os testes RIFI e ELISA foram baixos, 52% e 64% respectivamente, apresentando reações cruzadas com soros de cães infectados com T. cruzi, L. braziliensis e E. canis, ao passo que a especificidade do DAT foi alta, de 95%, apresentando somente um animal com E. canis, com sorologia positiva para LVC, da mesma forma, em outros estudos realizados em Córsega, no Mediterrâneo, os autores observaram para o DAT, 100% de especificidade.5,13 Por outro lado, em outros estudos utilizando amostras de soro de três cães infectados por Babesia sp. e de um cão com erliquiose, não se observou reatividade cruzada quando submeteram estas amostras a RIFI para LVC.16
A melhor estimativa para o valor do parâmetro especificidade foi encontrada na diluição 1:40 (E= 97,7%), embora a diluição 1:80 apresente a melhor estimativa para o parâmetro sensibilidade (S= 80,2%) (Tabela 3). Estes resultados mostram a possibilidade de escolha das diluições de corte e das tomadas de decisão mais adequadas para o ponto de corte. Por exemplo, a diluição 1:40 com ponto de corte maior que 26,7% apresenta as melhores estimativas de especificidade e valor preditivo positivo, permitindo que os cães verdadeiros negativos não sejam sacrificados. Por outro lado, quando se escolhe a diluição 1:80, com melhor índice de sensibilidade (80,2%) e especificidade mais baixa (79,5%), o valor preditivo positivo também diminui (53,2%), promovendo a possibilidade de cães sadios serem sacrificados. De qualquer forma a decisão a ser tomada implica conhecimento dos custos e benefícios que o ponto de corte escolhido possa oferecer.
A Tabela 3 apresenta valores para classificação incorreta em torno de 20%, 18% e 17%, nas diluições 1:20, 1:40 e 1:80, respectivamente, mostrando que este parâmetro também deve ser avaliado juntamente com a sensibilidade e especificidade. A comparação dos resultados obtidos em cada uma das diluições da RIFI-BM com a diluição 1:20 da RIFI-CH (teste- referência) indica que muitos soros não apresentaram concordância, provavelmente devido a diferenças antigênicas dos dois antígenos e pela diminuição de avidez do anticorpo, ou uma questão de zona de equivalência da reação antígeno-anticorpo entre os soros analisados. Assim, observou-se uma diminuição da sensibilidade nas diluições 1:20 e 1:40 em relação à diluição 1:80 e 1:160, que apresenta o parâmetro classificação incorreta igual a 11%. A escolha da diluição 1:40 com ponto de corte superior a 25% seria melhor, pois, embora a estimativa de sensibilidade seja 68,3%, o intervalo de confiança está dentro do intervalo de confiança da diluição 1:80 que apresenta sensibilidade 80,2% e na diluição 1:40, a estimativa do parâmetro especificidade é o que apresenta maior valor 98,0% e classificação incorreta varia muito pouco entre as duas diluições (0,18 e 0,17).
Na literatura, alguns autores consideram que a melhor diluição de corte para o teste RIFI é 1:80.12,14,15 No caso do teste RIFI-BM utilizado em programas de vigilância e controle da leishmaniose visceral, a diluição 1:40 é geralmente preconizada como diluição de corte, mas considerando a leitura de 1+ como positiva. Assim, o valor estimado para sensibilidade e especificidade igual a 57,5% resulta uma diferença de quase 40% na especificidade e, após a reclassificação, a especificidade foi 97,5%.
Estudos têm observado altos níveis de sensibilidade e especificidade nos testes sorológicos utilizados em inquéritos caninos. Estudos de revisão1 sobre diagnóstico de LVC com teste RIFI apresentam valores de sensibilidade variando de 90 a 100% e especificidade de 80% para amostras de soro. Outros autores12 apontaram para a RIF valores de sensibilidade e especificidade de 98,4% e 100%, respectivamente. Outros estudos11 compararam resultados sorológicos de amostras de 86 cães com exame parasitológico positivo, em cinco laboratórios que realizam diagnóstico sorológico de LVC, por meio dos testes RIFI e ELISA. Para o teste de RIFI a sensibilidade variou de 98,8% a 100% e a especificidade de 94,7% a 100% e para o ELISA estes valores foram 98,8% a 100% de sensibilidade e 96,5% a 100% de especificidade. Considerando a semelhança entre os resultados desses estudos, parece haver um viés na amostragem, uma vez que a comparação do teste sempre é feita utilizando painéis de soros conhecidos, ou seja, não utilizam amostras populacionais de regiões endêmicas e não endêmicas, prejudicando a verdadeira avaliação do teste, ocasionando uma super estimativa dos parâmetros.
Todavia, os valores reais dos parâmetros de sensibilidade e especificidade observados na Figura 1 e Tabela 3 são mais próximos dos valores esperados para populações de cães que apresentam o status da doença distribuídos homogeneamente, ou seja, doentes (sintomáticos, oligossintomáticos e assintomáticos) e sadios, como observado na população de grupo A. Por outro lado, a população do grupo B foi constituída por uma maioria de cães verdadeiros positivos, apresentando viés de amostragem e, conseqüentemente, distorcendo os valores de sensibilidade e especificidade. Tal fato ocorre rotineiramente nos estudos realizados com os testes em que se utilizam amostras não aleatórias para avaliação dos kits de diagnósticos.
Outra questão relevante no uso do teste RIFI-BM nos inquéritos sorológicos é a sua utilização em amostras colhidas em papel filtro. Esta avaliação foi feita com soros do grupo B (Figura 2). Este grupo era constituído de amostras pareadas de soro e papel filtro, porém a maioria dos casos apresentava resultados fortemente positivos, ou seja, leituras da RIFI acima de 2+ (50%). Desta forma, a análise TG-ROC apresentou valores muito altos para as estimativas de sensibilidade e especificidade igual a 98% para as amostras dos soros, enquanto que para as amostras de sangue em papel filtro os referidos valores foram 73%, mostrando diferença de 25% na utilização de soro em relação ao papel filtro. Há vários estudos comparando resultados da RIFI realizada em amostras pareadas de soro e eluatos. Alguns trabalhos2,4 referem baixos valores para o parâmetro sensibilidade da RIFI com eluato, quando comparada com método de ELISA com soro. Por outro lado, outros autores encontraram elevada concordância nos resultados deste teste em amostras de soro e eluato.15
Tais considerações são importantes na avaliação de testes de diagnóstico, principalmente no que diz respeito à amostragem utilizada na comparação. Para evitar tal viés, estudos de validação de testes diagnósticos9 sugerem um roteiro com todas as variáveis que devem ser controladas para avaliação de testes de diagnósticos.
Em conclusão, o presente artigo mostra como a análise TG-ROC pode fornecer importantes informações sobre os testes de diagnósticos, como também apresenta sugestões sobre pontos de cortes que podem melhorar as estimativas dos parâmetros sensibilidade e especificidade do teste, e avaliá-los a luz do melhor custo e benefício. Além disso, oferece maior consistência para a tomada de decisões nas análises de resultados de inquéritos soro-epidemiológicos.
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Instituto Adolfo Lutz - Rio Claro
Rua Dez, 152 - Consolação
13500-090 Rio Claro, SP, Brasil
E-mail: ritsilva@terra.com.br
Revisado: 1/10/2008
Aprovado: 4/2/2009
a World Health Organization. Tropical disease research: progress 2003-2004. Seventeenth Programme Report of the UNICEF/UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research & Training in Tropical Diseases. TDR 2005. Geneva; 2005. (Programme Report, 17). Disponível em: http://www.who.int/tdrold/publications/publications/pr17.htm
b Camargo-Neves VLF, Glasser CM, Cruz LL, Almeida RG. Manual de Vigilância e Controle de Leishmaniose Visceral Americana do Estado de São Paulo. São Paulo: Ministério da Saúde. Secretaria de Estado da Saúde; 2006.
c Ministério da Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de Vigilância e Controle de Leishmaniose Visceral; 2006.
d A leitura realizada em microscópio de fluorescência (aumento 400 vezes) pode ser consultada na versão online da Revista de Saúde Pública em www.scielo.br/rsp
e Schoojans F. MedCalc statistic for biomedical research: software manual. Mariakerke: Medcalc Statistical Software; 1998.