Avaliação das citosinas produzidas por estreptococos β-hemolíticos em faringotonsilites agudas | Brazilian Journal of Otorhinolaryngology
Julho 2015 Avaliação das citosinas produzidas por estreptococos β-hemolíticos em...
Páginas 402-407 (Julho 2015)
Sydney Correia Leãoa, Ivanna Oliveira Lealb, Hertaline Menezes do Nascimento Rochab, Tania Maria de Andrade Rodriguesb
a Universidade Federal de S??o Paulo (UNIFESP), S??o Paulo, SP, Brasil
b Programa de P??s-gradua????o em Biologia (PROBP-UFS), Universidade Federal de Sergipe (UFS), S??o Crist??v??o, SE, Brasil
Tabela 1. Comparação dos níveis de citosinas (pg/mL) nos diferentes grupos de estreptococos β-hemolíticos através do teste ANOVA
Introdução: O patógeno mais comumente associado à faringotonsilite bacteriana é o estreptococoβ-hemolítico do grupo A, a despeito dos grupos B, C, F e G terem também sido associados com a faringotonsilite.
Objetivo: Determinar os níveis das citosinas TNF-α, IL-6, IL-4, e IL-10 na faringotonsilite bacteriana causada pelos estreptococos β-hemolíticos do grupo A e não-A (grupos B, C, F e G).
Método: O estudo foi conduzido em uma emergência pediátrica. A amostra estudada compreendeu crianças (entre 5 e 9 anos) com faringotonsilite aguda bacteriana diagnosticada entre dezembro de 2011 e maio de 2012. A pesquisa envolveu a coleta de amostras sanguíneas dos pacientes, a detecção, através do ELISA, de TNF-α, IL-6, IL-4, and IL-10, além da coleta de dois swabs orofaríngeos para isolamento bacteriano. Adicionalmente foi coletada a história médica dos participantes do estudo.
Resultados: No grupo estudado (idade média: 5,93 anos), a maior incidência de faringotonsilite foi observada no gênero feminino (64,76%). Foram detectadas maiores incidências de exsudatos tonsilares nos grupos A e C. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes dos níveis de citosinas entre os grupos. Porém os grupos A e o controle mostraram diferença nos níveis de IL-6 (p = 0.0016).
Conclusões: Os grupos A e C mostraram maiores níveis de citosinas que os grupos B e o controle, sugerindo mecanismos imunológicos similares.
Introduction: The most common pathogen in bacterial pharyngotonsillitis is group A β-hemolytic streptococcus, although groups B, C, F, and G have also been associated with pharyngotonsillitis.
Objective: To assess the levels of the cytokines TNF-α, IL-6, IL-4, and IL-10 in bacterial pharyngotonsillitis caused by group A and non-A (groups B, C, F and G) β-hemolytic streptococcus.
Methods: The study was conducted at a pediatric emergency care unit. The sample comprised children (5-9 years old) with acute bacterial pharyngotonsillitis diagnosed between December of 2011 and May of 2012. The research involved collection of blood samples from the patients, enzyme-linked immunosorbent assay detection of TNF-α, IL-6, IL-4, and IL-10, and collection of two oropharyngeal swabs for bacterial isolation. Additionally, the medical history of the study participants was also collected.
Results: In the studied group (mean age: 5.93 years), higher pharyngotonsillitis incidence was observed in the female gender (64.76%). Higher incidence of tonsillar exudates was observed with groups A and C. No statistically significant differences in cytokine levels were observed among groups. However, the group A and the control group showed a difference in the IL-6 level (p = 0.0016).
Conclusions: The groups A and C groups showed higher cytokine levels than the groups B and control groups, suggesting similar immunological patterns.
Faringotonsilite aguda (FT) é uma das condições mais comuns encontradas por pediatras, otorrinolaringologistas e clínicos gerais em suas práticas diárias. Estima-se que mais de 50% dos casos de FT sejam de origem viral; e que dentre os casos bacterianos, o patógeno mais comum seja o estreptococoβ-hemolítico do grupo A (EGA).1-3 Contudo, estreptococosβ-hemolíticos dos grupos B, C, F e G (especialmente C e G) também podem causar FT de uma maneira autolimitada e sem sequelas supurativas, como, por exemplo, a febre reumática.4,5
Nos últimos 50 anos, a incidência global de faringotonsilites bacterianas causadas pelos grupos B, C, F e G têm aumentado. Um estudo de 2011, abordando a prevalência dos grupos de estreptococos β-hemolíticos C e F em pacientes com faringite aguda, demonstrou que estes micro-organismos causam FT em 6,2% de todos os casos de infecções estreptocócicas agudas.6-8
Por sua vez, os estreptococos dos grupos C e G (EGC e EGG) têm sido descritos como pyogenes-like, porque estes organismos compartilham importantes fatores de virulência, tais como hemolisinas, estreptolisina O, enzimas extracelulares e proteínas M, de modo semelhante aos EGA. Eles também podem causar FT exsudativa isolada além de celulite, tornando-se, assim, clinicamente indistinguíveis aos EGA. Estudos prévios demonstram que o EGC provoca uma forte resposta imunológica, como pode ser visto a partir do aumento da titulação de antiestreptolisina O (ASO) durante a infecção por estreptococos da orofaringe.9-11 O EGB também apresenta fatores de virulência de modo similar ao EGA, incluindo hemolisinas, polissacarídeos encapsulados e peptidase do C5a; e em algumas cepas, a hialuronidase pode também aparecer.12
1. Ter hipótese diagnóstica de FT bacteriana evidenciada por pelo menos dois sintomas: odinofagia repentina, febre, dor de cabeça, náusea, vômito e dor abdominal, inflamação tonsilofaringeal, petéquias palatinas, adenite cervical anterior e rash escarlatiniforme.
2. Não apresentar histórico de doença cardiovascular
3. Residir no município de Aracaju.
Os swabs de orofaringe foram coletados mediante técnica descrita por Levy et al. (2004) a fim de serem cultivados para recuperação do Streptococcus sp. A técnica utilizada seguiu a sequência descrita: Foi solicitado ao paciente que abrisse bem a boca; utilizando um abaixador de língua e swabs estéreis foram realizados esfregaços sobre as amígdalas e faringe posterior, com o objetivo de coletar o material nas áreas mais próximas aos pontos de supuração, evitando outros sítios da cavidade oral.14
Para a identificação presuntiva das colônias de estreptococos beta-hemolíticos, os espécimes foram semeados em placa de Petri com ágar sangue de forma asséptico, e incubado por 24 horas na estufa bacteriológica, em jarra, através do método da vela a 35° ± 2 °C. Após a incubação, as colônias foram testadas com catalase com o intuito de eliminar os Microccocacea (estafilococos), que geralmente dão resultado positivo para atividade da catalase, enquanto que os estreptococos, em geral, apresentam o teste da catalase negativo. Como teste comprobatório, a coloração de Gram foi feita nas colônias catalase negativas, com posterior visualização do aspecto morfológico e tintorial dos espécimes no microscópio óptico sob óleo de imersão.
Após a confirmação microscópica dos estreptococos, um teste de co-aglutinação usando o Phadebact® Strep AD, F e G
Test − Bactus AB TEST® foi realizado. As colônias de estreptococos β-hemolíticos do grupo A (Streptococcus pyogenes) foram identificadas através da utilização de bacitracina em uma concentração em 0,04 UI, com a formação da zona de inibição como resultado de sensibilidade.
A amostra sanguínea coletada de cada paciente, 4 mL, foi acondicionada em frasco contendo gel separador e centrifugada a 5.000 rpm por 15 minutos, sendo o soro aliquotado em três amostras de 500 µl e armazenado a −80 °C. A técnica do teste ELISA para todas as citosinas foi realizada de acordo com as orientações do fabricante do kit ELISA Ready-SET-Go!®, da EBIOSCIENCE. As concentrações das citosinas séricas foram determinadas em pg/mL, utilizando curvas-padrão previamente descritas pelo fabricante: IL-4 (2 pg/ mL-200 pg/ mL); IL-6 (2 pg/mL-200 pg/mL); IL-10 (2 pg/mL-300 pg/ mL); e TNF-α (2 pg/mL-200 pg/mL).
A técnica da dosagem da proteína C-reativa (PCR) foi desenvolvida de acordo com o fabricante (BIOTÉCNICA – kit Turbilátex). Basicamente, o método consiste na aglutinação de partículas de látex recobertas com anticorpos anti-PCR humanos pela proteína C-reativa (PCR) presente na amostra. A aglutinação provoca acréscimo na absorbância proporcional à concentração de PCR na amostra e, por comparação, com um calibrador de PCR de concentração conhecida, pode-se determinar o conteúdo de PCR na amostra ensaiada em 540 nm.
Os dados foram armazenados em banco de dados em planilha do Microsoft Excel 2010. Para comparação das citosinas estudadas, bem como os sinais e sintomas entre os grupos, foi utilizado o teste ANOVA e Kruskal-Wallis, com pós-teste de Bonferroni's e Dunn's, respectivamente, e intervalo de confiança de 95%. Os dados foram analisados utilizando software GraphPad-Prisma5 (GraphPad software, San Diego, CA-USA).
Em relação aos achados microbiológicos, foi observado que os estreptococos α-hemolíticos ocorreram em 46,55% da população estudada. Colônias β-hemolíticas foram isoladas de 36,21% das amostras. Destes isolados, 47,61% foram catalase positivo, presumivelmente Staphylococcus aureus, enquanto que 52,39% foram catalase negativo, presumivelmente Streptococcus sp. Os isolados de catalase negativo foram testados adicionalmente utilizando-se o teste de co -aglutinação de látex, e os resultados deste teste foram usados para subdividir os estreptococos beta-hemolíticos nos grupos A, B e C de Lancefield; outros grupos não foram detectados entre as amostras. Em relação aos diferentes grupos, EGA mostrou uma incidência de 36% entre as amostras estreptocócicas isoladas, enquanto que a incidência de EGC e EGB foi de 18% e 46% entre os isolados, respectivamente.
O desenvolvimento e a regulação de uma resposta autoimune dependem da produção e liberação de citosinas, as quais podem determinar a diferenciação de células T antígeno-específico em uma apropriada linhagem de células T efetoras. A resposta imune à infecção é regulada pelo balanço entre os mecanismos indutores da produção de citosinas do padrão Th1 e do Th2. As citosinas derivadas do padrão Th1 (IL-2 e IFN-γ) induzem a uma resposta imune por via celular, enquanto que a citosina derivada do padrão Th2 (IL-4) suprime a resposta mediada por via celular e induz à resposta humoral, a qual envolve a liberação de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10.15,16
Os níveis das citosinas pro-inflamatórias nos grupos EGA e EGC apresentaram valores médios maiores do que aqueles nos grupos EGB e controle; de modo semelhante, as médias das citosinas anti-inflamatórias estiveram mais elevadas nos grupos EGA e EGC, sugerindo mecanismos imunológicos similares. No intuito de avaliar o grau de homeostase entre a produção das citosinas pro-inflamatórias e os fatores anti -inflamatórios, calculou-se a razão do TNF-α em relação às citosinas anti-inflamatórias IL-4 e IL-10. A proporção foi a maior para a infecção por EGC, sugerindo tendência a uma resposta imune e inflamatória mais aguda, com desvio ao padrão Th1.16
Figura 1 Distribuição das frequências relativas de sinais e sintomas entre os diferentes grupos β-hemolíticos. Observam-se maiores frequências relativas de exsudatos tonsilares nos grupos A (EGA) e C (EGC).
Os níveis de IL-6 no soro de crianças com FT causada por estreptococos beta-hemolíticos aumentaram entre os diferentes grupos em relação ao grupo controle. O IL-6 estimula hepatócitos a produzir, em níveis elevados, proteínas da fase aguda, tais como a proteína C-reativa (PCR), durante a infecção ativa ou o processo inflamatório agudo, dando-lhe o status de marcador inflamatório.17-19 No presente estudo, os níveis médios de PCR em EGA foram maiores do que nos outros grupos, sugerindo uma resposta inflamatória mais intensa (tabela 2).
Apesar do EGA e do EGC compartilharem fatores de virulência, como a proteína M, a qual é considerada o principal fator responsável pela virulência e patogênese da febre reumática aguda, o EGC não está relacionado a esta complicação não supurativa, podendo ser apenas associado à glomerulonefrite aguda.4,9 Contudo, contrapondo esta informação, Haidan et al. (2000) mostraram que nas FTs causadas pelos grupos EGB e EGG em uma população aborígene houve uma maior incidência de febre reumática, além de uma baixa incidência de infecção pelo EGA, sugerindo que, in vitro, EGB e EGG, sob condições específicas, teriam potencial de iniciar uma resposta autoimune, a qual poderia emular um quadro de febre reumática aguda.20-22 Este achado indica a importância clínica desta bactéria e que é apropriado para investigar e tratar as FTs causadas pelo EGC, como também pelo EGA.
Conclui-se que as FTs causadas pelo EGA, EGB e EGC mostraram incidências representativas e com sinais e sintomas similares. Contudo, as FTs causadas pelo EGA e EGC são mais agudas, conforme refletido pela resposta imune e pelos níveis elevados de citosinas pro-inflamatórias, sugerindo que os mecanismos imunológicos dos dois grupos sejam similares.23,24 Esta semelhança na resposta imune sob estas condições poderia ser atribuída ao compartilhamento de fatores de virulência, tais como a proteína M e a estreptolisina O. O EGB identificado neste estudo também causa FT em crianças, apesar de ele ter induzido respostas imunitárias e clínicas menos agressivas do que o EGA e o EGC.
Este estudo foi financiado pelo CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, Brasília, DF, Brasil) e FAPITEC (Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica de Sergipe, Aracaju, SE, Brasil).
Recebido em 23 de abril de 2014;
aceito em 24 de agosto de 2014
DOI se refere ao artigo: http://dx.doi.org/10.1016/j.bjorl.2015.05.003
☆ Como citar este artigo: Leão SC, Leal IO, Rocha HMN, Rodrigues TMA. Evaluation of cytokines produced by β-hemolytic streptococcus in acute pharyngotonsillitis. Braz J Otorhinolaryngol. 2015;81:402-7.
☆☆ Instituição: Grupo de Anatomia Molecular, Departamento de Morfologia, Universidade Federal de Sergipe (UFS), São Cristóvão, SE, Brasil.
E-mail:sydneyleao@hotmail.com (S.C. Leão).
A conduta frente ao paciente com faringite aguda. J Pediatr. 2005;81:1-2.
Anti-biogram in acute pharyngitis: a study of 137 children cases. Dinajpur Med Col J. 2008;1:40-4.
Diretrizes brasileiras para diagn??stico, tratamento e preven????o da febre reum??tica da Sociedade Brasileira de Cardiologia, da Sociedade Brasileira de Pediatria e da Sociedade Brasileira de Reumatologia. Arq Bras Cardiol. 2009;93:1-18.
VI Manual de otorrinolaringologia pedi??trica da IAPO. S??o Paulo: Gr??fica e Editora RR Donneley Ltda; 2007.
Caracter??sticas das bact??rias que causam IRA nas crian??as: considera????es atuais para seu diagn??stico. Se????o II: aspectos etiol??gicos. Em: Benguigui Y, Antu??ano FJL, Schmunis G, Yunes J. Infec????es respirat??rias nas crian??as. Washington: Organiza????o Pan-Americana de Sa??de; 1999.
Incid??ncia de amigdalite aguda na popula????o sob observa????o pela Rede M??dicos-Sentinela no ano de 1998. Rev Port Clin Geral. 2002;18:99-108.
Pyogenic streptococci - danger of re-emerging pathogens. Pol J Microbiol. 2010;59:219-26.
Prevalence of β-hemolytic groups C and F streptococci in patients with acute pharyngitis. N Am J Med Sci. 2011;3:129-36.
The role of group C and group G streptococci in acute pharyngitis in children. Clin Microbiol Infect. 2004;10:37-40.
Severe acute pharyngitis caused by group C Streptococcus. J Gen Intern Med. 2007;22:272-4.
The human immune response to streptococcal extracellular antigens: clinical, diagnostic, and potential pathogenetic implications. Clin Infect Dis. 2010;50:481-90.
Streptococcus and enterococcus: pharyngitis; scarlet fever; skin and soft tissue infections; streptococcal toxic shock syndrome; pneumonia; meningitis; urinary tract infections; rheumatic fever; post-streptococcal glomerulonephritis. Em: Greenwood D, Slack RCB, Barer MR, Irving WL. Medical microbiology: a guide to microbial infections; pathogenesis, immunity, laboratory diagnosis, and control. 18?? ed. London: Churchill Livingstone Elsevier; 2012. p. 183-98.
Clinical practice guideline for the diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis: 2012 update by the Infectious Diseases Society of America. IDSA Guideline for GAS Pharyngitis. Clin Infect Dis. 2012;55:e86-102.
Manual de microbiologia cl??nica para o controle de infec????o em servi??os de sa??de. Bras??lia: Editora Ag??ncia Nacional de Vigil??ncia Sanit??ria; 2004.
Induction of TGF-β1 and TGF-β1-dependent predominant Th17 differentiation by group A streptococcal infection. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:5937-42.
Avalia????o quantitativa das citocinas IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e do TGF-β, presentes na saliva de pacientes com periodontite, antes e ap??s a submiss??o ?? psicoterapia: an??lise comparativa com pacientes controles. Bauru: Universidade de S??o Paulo, Faculdade de Odontologia de Bauru; 2012.
Review: Inflammation in atherosclerosis: from vascular biology to biomarker discovery and risk prediction. Clin Chem. 2008;54:124-38.
Capacidade dos biomarcadores inflamat??rios em predizer a s??ndrome metab??lica. Arq Bras Endocrinol Metab. 2008;52:537-49.
Inflammation in atherosclerosis: transition from theory to practice. Circ J. 2010;74:213-20.
Pharyngeal carriage of group C and group G streptococci and acute rheumatic fever in an Aboriginal population. Lancet. 2000;356:1167-9.
Fundamental immunology. 6?? ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2008.
Resposta imune ??s doen??as infecciosas. Medicina (Ribeir??o Preto). 2009;42:127-42.
Diagn??stico microbiol??gico. 5?? ed. Rio de Janeiro: MEDSI Editora M??dica e Cient??fica Ltda; 2001.