Miniaturização Eficaz de Preparo de Bibliotecas Illumina Nextera XT para Aplicações de Sequenciamento Multiplexado de Genoma Completo e de Microbioma Discovery in Motion | Newslab
Miniaturização Eficaz de Preparo de Bibliotecas Illumina Nextera XT para Aplicações de Sequenciamento Multiplexado de Genoma Completo e de Microbioma Discovery in Motion
Publicado por Luciene Almeida em 17 de agosto de 2021
Entenda como o equipamento Echo 525 pode proporcionar a redução de custos para o pesquisador e maior rendimento possível com a mesma quantidade de reagentes fornecidos.
Por Jefferson Lai, John Lesnick, Noël Ruppert
O custo do sequenciamento por nucleotídeo vem diminuído por ordens de magnitude durante os últimos 10 anos; no entanto, o preparo de amostras para o sequenciamento da próxima geração permanece um componente caro do processo. Na biologia sintética, o sequenciamento de genomas microbianos completos está se tornando um processo rotineiro para validar a edição de genomas, deconvoluir campanhas de mutagênese, confirmar construção de DNA de alto rendimento, e pesquisar amostras de microbiomas. Aqui detalhamos um método para miniaturizar volumes de reação utilizados no kit de bibliotecas de DNA Illumina Nextera XT, reduzindo assim o custo global por reação e mantendo dados equivalentes ao protocolo padrão. Testamos então este método miniaturizado em uma variedade diversificada de micróbios para mostrar que o método é eficaz entre as amostras. Finalmente, aplicamos este método a um estudo de microbioma e descobrimos que ele mantém a diversidade, as proporções e identificação da amostra.
O custo do sequenciamento por nucleotídeo vem diminuído por ordens de magnitude ao longo dos últimos 10 anos devido à melhoria contínua nas tecnologias de sequenciamento de próxima geração. No entanto, o preparo da bibliotecas permanece um gargalo para reduzir os custos de sequenciamento.
Na biologia sintética, o sequenciamento de genoma completo está se tornando um processo rotineiro para validar a edição de genomas, deconvoluir campanhas de mutagênese, confirmar a construção de DNA de alto rendimento e pesquisar amostras de microbiomas.
Os esforços atuais para sequenciar genomas pequenos (bacterianos, fúngicos) usando um fluxo de trabalho baseado no Illumina Nextera XT são restritos pelos volumes mínimos de trabalho necessários para o processamento manual e, uma vez processados, somente uma pequena fração da biblioteca gerada é usada para a rodada de sequenciamento.
Utilizando o Manipulador de Líquidos Echo 525 com o kit Nextera XT, realizamos as reações em escala miniaturizada que reduz o excesso de geração de bibliotecas, assim economizando custos com reagentes caros. Além disso, rodar reações de tagmentação de menor volume também reduz a quantia de amostra de gDNA necessária. Demonstramos que as reações de tagmentação e amplificação podem ser reduzidas até 20 vezes.
Essas bibliotecas foram multiplexadas em uma rodada de sequenciamento de extremidade pareada de Illumina MiSeq e ficou demonstrado que produzem métricas equivalentes. A precisão de nanolitro e a velocidade do Manipulador de Líquidos Echo 525 permite miniaturização exata do preparo da biblioteca de Nextera XT e medidas de QC tais como o ensaio de quantificação Quant-iT Picogreen e a análise de fragmentos Agilent TapeStation 2200, reduzindo assim o custo e aumentando o rendimento e, ao mesmo tempo, oferecendo dados de sequenciamento de alta qualidade. Além disso, o Manipulador de Líquidos Echo 525 nos permitiu normalizar e centralizar nossas bibliotecas para sequenciamento a uma velocidade sem precedentes em comparação com qualquer outro manipulador de líquidos baseado em ponteira.