Qualidade sanitária de grãos e frutos de amendoim comercializados no estado de Alagoas e identificação através de características culturais de espécies do gênero Aspergillus
https://doi.org/10.1590/S0100-54052010000400005
Sanitary quality of peanut grains and fruits comercializated in Alagoas state and Aspergillus species identification by cultural characteristic
Edna Peixoto da Rocha Amorim; Roseane Cristina Trindade Predes; Arlinda Pereira Eloy; Ícaro Cardoso Bezerra*; Laís Peixoto da Rocha Soares*; Julio Cesar da Silva**
Universidade Federal de Alagoas, Centro de Ciências Agrárias, Campus Delza Gitaí, BR 104N, KM 87, 57000- Rio Largo-AL
A identificação de espécies fúngicas presentes em grãos e frutos de amendoim (Arachis hypogaea), bem como a caracterização cultural das espécies de Aspergillus detectadas, é um importante passo para a prevenção da presença de micotoxinas no substrato, garantindo a qualidade do produto, tanto para a comercialização in natura quanto já processado. A partir de grãos e frutos de amendoim comercializados, in natura ou processados, no estado de Alagoas foram isolados os fungos Aspergillus flavus, A. niger, A. ochraceus, A. parasiticus, Fusarium verticillioides (= F. moniliforme), F. equiseti, Rhizopus stolonifer, Botrytis cinerea, Penicillium italicum e Colletotrichum sp. De um modo geral, os grãos processados apresentaram menor incidência de fungos, diferindo estatisticamente dos grãos in natura, com destaque para as espécies A. flavus, A. parasiticus, F. verticillioides e F. equiseti. As espécies de Aspergillus foram identificadas com base nas características culturais, exibidas em meio de Czapek-ágar, e morfológicas, através de microscópio ótico. No oitavo dia de crescimento em meio de BDA, cada espécie apresentou diferenças quanto à taxa de crescimento durante o período de incubação, de acordo com a procedência das amostras dos grãos ou frutos.
Palavras-chave adicionais: Etiologia, pós-colheita, patologia de grãos.
The identification of fungal specie presents in fruits and grains of the peanut (Arachis hypogaea) and the cultural characterization of the Aspergillus species are important for preventing micotoxin contamination of peanut products commercialized in natura or processed. The fungi Aspergillus flavus, A. niger, A. ochraceus, A. parasiticius, Fusarium verticillioides (= F. moniliforme), F. equiseti, Rhizopus stolonifer, Botrytis cinerea, Penicillium italicum and Colletotrichum sp. were isolated from fruits and grains from peanut comercializated in natura or processed in the State of Alagoas, Brazil. The processed grains presented significantly less incidence of fungi than grains in natura mainly regarding to the species A. flavus, A. parasiticus, F. verticillioides and F. equiseti. Aspergillus species were identified based on cultural characteristics on Czapek-agar medium and morphological structures viewed under optical microscope. The development of each fungal species on potato-dextrose-agar (PDA) medium presented differences for colony rate of growth according to the fruits and grains samples from which were obtained.
Keywords: Etiology, postharvest, grains pathology.
O amendoim (Arachis hypogaea L) é cultivado em larga escala nas Américas do Norte e do Sul, África e Ásia, para fins de extração de óleo, consumo in natura, confecção de doces e farelo/torta. Entre as oleaginosas comestíveis, apresenta um rendimento industrial superado somente pelo girassol, com média de aproveitamento em torno de 40%, para óleo, e 50% para farelo. Predominantemente é usado na indústria de gêneros alimentícios, graças à nobre qualidade de seu óleo (22).
O amendoim é altamente deteriorável quando atinge o estado de maturação fisiológica, podendo ser afetada por diversas doenças, dentre as quais, encontram-se aquelas causadas por fungos, que podem ocorrer ainda no armazenamento dos grãos e em todo o ciclo da cultura, alterando a qualidade do alimento, necessitando ser colhido seco o mais rapidamente possível (13). Assim sendo, a colheita deve ser realizada em períodos secos para não prejudicar a qualidade dos frutos e grãos.
Destacam-se as podridões de Aspergillus (Aspergillus niger, A. flavus, A. parasiticus), o mofo cinzento (Botrytis cinerea), o mofo branco (Sclerotinia minor e S. sclerotiorum), a fusariose (Fusarium spp.), a rizoctoniose (Rhizoctonia solani), a murcha de sclerotium (Sclerotium rolfsii) e a antracnose (Colletotrichum spp.), todas consideradas de importância econômica (4).
Os fungos que infectam os frutos e grãos podem produzir micotoxinas, substâncias metabólicas liberadas ou não em substratos nos quais eles crescem como grãos e / ou frutos (17). Destas, as principais são as aflatoxinas, tóxicas ao homem e aos animais, por apresentarem atividade carcinogênica, teratogência e mutagênica, em condições de umidade (80% a 90%) e temperatura ambiente favorável (> 20ºC), o que afeta a aceitação do produto para o consumo (13).
No Brasil, o amendoim é o substrato mais suscetível à contaminação por aflatoxinas (AFTs), produzida por Aspergillus sp., Penicillium sp. e Rhizopus sp. Conforme Caldas et al. (7), amostras de amendoim oriundas de regiões do Estado de São Paulo, apresentaram 90% de contaminações com fungos produtores de micotoxinas, tais como A. flavus e Fusarium spp., com resultados positivos para aflatoxina de 183 µg/Kg.
Na região Nordeste, o consumo de amendoim in natura ou processado (cozido ou torrado) é muito comum, principalmente na região litorânea. Praticamente todo o amendoim consumido nesta região é oriundo do Estado de São Paulo. A identificação de espécies fúngicas presentes em frutos e grãos de amendoim comercializados em Maceió, bem como a caracterização cultural das espécies de Aspergillus detectadas, é um importante passo para a prevenção da presença de micotoxinas no substrato, garantindo a qualidade do produto, tanto para a comercialização in natura quanto para o processado.
Devido à importância econômica da cultura do amendoim e a necessidade de uma vigilância contínua da condição de sanidade dos grãos destinados ao consumo, a presente pesquisa objetivou isolar e identificar espécies fúngicas em frutos e grãos de amendoim in natura e processados, bem como diferenciar as espécies de Aspergillus através da caracterização cultural das mesmas.
Obtenção e Identificação de fungos em grãos e frutos de amendoim
Os experimentos foram realizados no Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal de Alagoas e constaram de testes de laboratórios. Foram utilizadas amostras de amendoim (fruto in natura, ou seja, frutos retirados das vagens, grãos in natura e grãos processados, ou seja, torrados), oriundas do Estado de São Paulo e comercializadas no mercado público e Ceasa-AL. As amostras de frutos/grãos foram analisadas para sanidade empregando-se o método do papel de filtro com modificações (14), utilizando-se 200 frutos/grãos de amendoim, previamente desinfestadas com hipoclorito de sódio (NaOCl) a 2% v/v de cloro ativo por cinco minutos, foram distribuídas em caixas gerbox (20 grãos/gerbox), sobre papel de filtro umedecido com água destilada esterilizada (14, modificado). A incubação foi realizada sob temperatura média de 25º C e sob regime de iluminação com fotoperíodo de 12h, durante o período de oito dias. A avaliação consistiu na observação e identificação da presença de fungos na superfície dos frutos e grãos, sob microscópio estereoscópico, quantificando-se a incidência de todos os fungos presentes nas amostras.
Culturas puras dos fungos detectados foram obtidas, mediante a transferência de esporos que colonizavam os grãos, para placa de Petri, contendo meio de Batata-Dextrose-Ágar (BDA) e incubados sob alternância luminosa e temperatura de 28ºC.
Para identificação, com bases culturais, morfológica e morfométricas das colônias, foram preparadas microculturas em blocos de BDA (1cm2) inoculados lateralmente em quatro pontos, com estruturas fúngicas e, em seguida, cobertos com lamínula. As microculturas foram incubadas em câmara úmida por um período de 24 horas a 48 horas, em condições de laboratório, sob temperatura média de 28ºC. Após a incubação, as lamínulas foram transferidas para lâminas coradas com azul de Amann e examinadas ao microscópio óptico comum, para observação das características macro e micromorfológicas e identificação segundo os critérios estabelecidos por Ellis (11, 12), Sutton (21) Burgess et al. (6), Schipper (19) e Barnett & Hunter (3).
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente ao acaso, com três tratamentos e oito repetições de 200 grãos cada, totalizando 1600 frutos/grãos por tratamento. Foi realizada análise de variância para as incidências de fungos, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5%.
Caracterização cultural de espécies de Aspergillus
A partir de colônias do gênero Aspergillus, discos de micélio de aproximadamente 3mm foram retirados e, em seguida, plaqueados em meio de Czapeck-ágar. As placas assim preparadas foram incubadas sob alternância luminosa e temperatura de 28ºC. Os estudos das características culturais e morfológicas das espécies de Aspergillus foram confrontadas com aquelas descritas por Raper & Fennel (17) e Singh et al.(20). Para cada espécie identificada, repicou-se discos de 3mm, contendo micélio, para o centro de uma placa contendo BDA. Foram empregadas quatro repetições por isolado e a incubação permaneceu a mesma citada anteriormente. A partir do segundo até o oitavo dia de incubação, foram realizadas medições dos diâmetros das colônias, com auxilio de uma régua milimetrada, em dois sentidos diametralmente opostos. Foram consideradas as seguintes variáveis: diâmetro da colônia no oitavo dia de incubação e a taxa de crescimento micelial, correspondendo esta última ao coeficiente de regressão (b) obtido da equação y= a + bx, relativos ao diâmetro (y) plotados durante os oito dias de incubação (x), sendo "a" o diâmetro inicial. Na análise estatística (delineamento inteiramente casualizado) as médias das variáveis foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Ocorrência de fungos em grãos in natura e processados e frutos in natura de amendoim
Os resultados obtidos em relação à incidência dos fungos presentes nos grãos in natura e processado e frutos in natura de amendoim são apresentados na Tabela 1.
Observa-se um total de dez espécies fúngicas distribuídas em seis gêneros, dos quais destacaram-se pela maior incidência: Fusarium (51,42%), Aspergillus (42,56%) e Rhizopus (4,87%), perfazendo 98,85% do total obtido nos grãos in natura; Fusarium (31,03%) e Aspergillus (25,32%) correspondendo a 56,35% do total obtido em frutos in natura; Aspergillus (3,99%) e Fusarium (4,0%), ou seja 7,99% do total obtido em grãos processados. Em geral, os gêneros Aspergillus e Penicillium são freqüentes em sementes, sendo considerados fungos de armazenamento e podem contribuir para a degradação das sementes, durante o período de armazenamento, em condições desfavoráveis à manutenção da boa qualidade das sementes, além de estarem envolvidos na produção de micotoxinas- AFLt (8).
Com relação ao gênero Aspergillus (Tabela 1), foram detectadas quatro espécies deste fungo, já reportadas em sementes de amendoim, feijão, girassol e outras plantas: A. flavus Link (5, 9, 15), A. niger van Tieghem (9, 15) A. parasiticus Speare (20) e A. ochraceus Wilhelm (15). Dentre estas, destacaram-se A. flavus (25,44%) e A. niger (9,5%) em grãos in natura; A. flavus (0,37%), A. niger (3,5%) e A. parasiticus (0,12%) em grãos processados e A. flavus (6,5%), A. niger (16,5%), A . parasiticus (1,12%) e A. ochraceus (1,2%) em frutos in natura do total de fungos isolados em cada tratamento. A presença de A. flavus e A. parasiticus, que causam o mofo amarelo do amendoim, apesar de ser considerada uma doença de pequena importância, constitui um dos mais sérios problemas para o consumo do amendoim, devido à possibilidade de produção de aflatoxinas (4), que provocam alterações orgânicas que levam a hemorragias e câncer hepático se ingeridas por longo período, mesmo em baixas quantidades (2).
No gênero Fusarium foram detectadas duas espécies, F. verticillioides (= F. moniliforme Sheld.) e F. equiseti (Corda) Sacc., reconhecidamente patógenos de amendoim (Frank e Bem Yephet, 1997, citados por Santos, 2005 (18), que mostraram uma incidência de 48,85% e 2,57% em grãos in natura, 3,50% e 0,50% em grãos processados e 29,5% e 1,53% em frutos in natura, respectivamente, do total de fungos isolados. As espécies de Fusarium são comumente relatadas em grãos de várias culturas, sem sintomas aparentes. De acordo com Champion (8), algumas espécies de Fusarium podem atuar tanto como saprófitas, quanto como parasitas importantes, depreciando a qualidade do produto. Com relação às espécies de Fusarium detectadas neste trabalho, estas foram relatadas por Paz Junior & Menezes (15) em sementes de girassol, sem causar sintomas.
Dentre os demais fungos detectados, Rhizopus stolonifer se apresentou com incidência de 4,87%, 0,75% e 1,0%, respectivamente em grãos in natura, grãos processados e frutos in natura, Penicillium italicum (1,15% e 1,0%) em grãos e frutos in natura e Botrytis cinerea (0,2% e 0,38%) em grãos processados e frutos in natura.
As espécies Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides que ocorreram em maior incidência em grãos in natura, comparando-se com os frutos in natura e grãos processados, e que podem estar envolvidos na produção de micotoxinas (aflatoxinas) em amendoim, é bastante preocupante, considerando o alto consumo nas praias do estado de Alagoas. Neste trabalho os frutos e grãos de amendoim eram adquiridos no mercado local, mas foram oriundos do estado de São Paulo, onde a incidência de aflatoxinas tem sido um problema constante nos últimos anos (18).
Essa maior incidência de A. flavus e F. verticillioides nos grãos in natura e frutos in natura pode estar relacionada ao modo como esses grãos foram formados desde a condução no campo, colheita, secagem, transporte e armazenamento, reduzindo, dessa maneira sua qualidade sanitária. Em São Paulo, o amendoim é colhido durante os meses de alta precipitação pluviométrica. As altas temperatura e umidade dificultam a secagem após o arrancamento e o armazenamento, podendo favorecer o aparecimento de fungos produtores de toxinas (13).
Neste trabalho foi possível notar uma variação na incidência de fungos nos grãos e frutos de amendoim em função do tipo comercializado, processado ou in natura, onde se verifica maior incidência de fungos nos grãos e frutos in natura (100% e 58,93%, respectivamente). Este fato pode ter sido decorrente de que, ao torrar os grãos, a temperatura do processamento diminuiu a proliferação de microrganismos, como também, o grão tornou-se mais seco e, portanto, mais propício ao armazenamento.
Os resultados da caracterização cultural das espécies de Aspergillus mostraram que para algumas das espécies de Aspergillus identificadas foram verificadas tendências diferentes de crescimento micelial (Figura 1). No oitavo dia de incubação o fungo A. flavus ocupou toda a superfície da placa, enquanto que os fungos A. niger, A. ochraceus e A. parasiticus não ocuparam. As taxas de crescimento micelial das espécies apresentaram diferenças significativas entre os isolados, sendo o observado decorrente das diferentes tendências de crescimento. Provavelmente, as diferenças observadas nas taxas de crescimento micelial das espécies se devem à variabilidade das espécies, que é um fenômeno genético comum. Resultados semelhantes foram observados por Araújo et al. (1) ao estudarem a associação de fungos a sementes de feijão e por Benicio et al. (5) ao identificarem e caracterizarem espécies do gênero Aspergillus em sementes de feijão.
1. Araújo,E.; Alcântara, R. L; Souza, F. A.; Almeida, F.A.C.; Carvalho, J. L.; Lima, A. A..A,; Lima, A. L., Menezes Neto, J.; Pontes, V.A. Fungos associados a sementes de feijão obtidas em diferentes municípios da Paraíba. Revista Brasileira de Sementes, Pelotas, v. 2, p. 109-115, 1980. [ Links ]
2. Baldissera, M. A.; Santurio, J. M.; Canto, S. H.; Pranke, P. H.; Almeida, C. A. A.; Schimidt, C. Aflatoxinas, ocratoxina A, zearalenona em alimentos para consumo animal no sul do Brasil. Revista do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, v. 53, n. 42, p. 6, 1993. [ Links ]
3. Barnett, H. L.; Hunter, B. B. Illustrated genera of imperfect fungi. 4th ed. New York: MacMillan, 1998. 218 p. [ Links ]
4. Barreto, M. Doenças do amendoim (Arachis hypogaea). In: Kimati et al. (Ed) Manual de fitopatologia: doenças de plantas cultivadas: 3. ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1997. v. 2, p. 63-77. [ Links ]
5. Benicio, V.; Araújo, E.; Souto, F. M.; Benicio, M. J.; Felismino, D. Identificação e características culturais de espécies do gênero Aspergillus isoladas de sementes de feijão no estado da Paraíba. Fitopatologia brasileira, Brasília, v. 28, n.2, p. 180-183, 2003. [ Links ]
6. Burgess, L. W.; Liddell, C. M.; Summerell, B. S. Laboratory manual for Fusarium research. Sydney: University of Sydney, 1988. 156 p. [ Links ]
7. Caldas, E. D.; Silva, S. C.; Oliveira, J. N. Aflotoxinas e ocratoxina A em alimentos e riscos para a saúde humana. Revista de Saúde Pública, Campinas, v.36, n. 3, p. 319-323, 2002. [ Links ]
8. Champin, R. Identifier les champignons transmis par les semences. Paris: Institut National de la Researche Agronomique, 1997. 398 p. [ Links ]
9. Chisholm, F. V.; Coates-Beckford, P. L. Fungi associated with seeds of three legumes in Jamaica and seed germination at harvest and after storage. Tropical Agriculture, v. 74, p. 121-127, 1997. [ Links ]
10. Dhingra, O. D. Patologia pós-colheita. Informe agropecuário, Belo Horizonte, v.11, n. 122, p. 46-50, 1985. [ Links ]
11. Ellis, M. B. Dematiaceous hyphomycetes. Kew: CAB, 1971. 608 p. [ Links ]
12. Ellis, M. B. More dematiaceous hyphomycetes. Kew: CAB, 1976. 505 p. [ Links ]
13. Godoy, i. J.; Savy Filho, A. Tango, J. S.; Ungaro, M. R. G.; Marioto, P. R. Programa integrado de pesquisas oleaginosas. Campinas: IAC, 1985. 33 p. [ Links ]
14. Neergaard, P. Seed Pathology. 2. ed. London: McMillan. 1979. 162p. [ Links ]
15. Paz Junior, F. B.; Menezes, M. Fungos endofíticos em sementes de girassol e diferenciação morfológica e enzimática de espécies de Fusarium. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.31, n.1, p. 87-93, 2005. [ Links ]
16. Prado, G; Oliveira, M. S. Efeito do forno de microondas na destruição de aflatoxinas em amendoim. Revista do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, v. 56, n. 2, p. 21-24, 1996. [ Links ]
17. Raper, K. B.; Fennel, D. I. The genus Aspergillus. Baltimore: Williams & Wilkinson, 1965. 205 p. [ Links ]
18. Santos R. C. O agronegócio do amendoim no Brasil. Campina Grande: Embrapa Algodão, 2005. 451p. [ Links ]
19. Schipper, M. A.A. A revision of the genus Rhizopus I. The Rhizopus stolonifer- group and Rhizopus oryzae. Baarn: Centralabureau coor Schimmelcultures, 1984. 34 p. [ Links ]
20. Singh, K.; Frisvad, J.C.; Thrane, U.; Mathur, S.B. An illustrated manual on identification of some seed-borne Aspergilli, Fusaria, Penicillia and their micotoxins. Copenhague: Danish government Institute of Seed Pathology for Developing Countries, 1981. 178p. [ Links ]
21. Sutton, B. C. Coelomycetes. Kew: CAB, 1980. 324 p. [ Links ]
22. Tasso Junior, L. C.; Marques, M. O.; Nogueira, G. A. A cultura do amendoim. Jaboticabal, 2004. 218p. Disponível em: <http://www.criareplantar.com.br/agricultura/amendoim.php. Acesso em: 17 jan. 2004. [ Links ]
23. Toledo, P. M. E.; Fonseca, H.; Oetterer, M. Contaminação e distribuição de aflatoxinas nos produtos e subprodutos do processamento via seca e via úmida do milho. Boletim da Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos, São Paulo, v. 31, n. 1, p.77-80, 1997. [ Links ]