Bolsa 21/05406-1 - Vesículas extracelulares - BV FAPESP
Estudo de possíveis alterações nos sistemas endocanabinoide, endovaniloide e neuroimune em sinapses cerebrais promovidas após estímulo de células da micróglia: envolvimento de mecanismos epigenéticos
Processo: 21/05406-1
Beneficiário: Sávio Lima Bastos
Assunto(s): Vesículas extracelulares
Resumos e objetivos: O objetivo inicial deste subprojeto é verificar o conteúdo de VEs liberadas por células da micróglia após serem estimuladas com ATP ou capsaicina, um agonista de receptores TRPV1. Além disso, verificar o efeito destas VEs na expressão sináptica de moléculas dos sistemas endocanabinoide, endovaniloide, imune e glutamatérgico, bem como enzimas responsáveis por modificações epigenéticas. Plano de trabalho: Metodologias a serem utilizadas: Animais: Camundongos da linhagem C57BL/6 recém-nascidos (1-3 dias de vida) ou camundongos fêmeas prenhes para obtenção de embriões com 14 dias. Drogas: Capsaicina, agonista TRPV1 (0,01-1 µM, Tocris)(36), LPS (10-100 ng/ml em cultura; Invivogen); ATP (0,1-10 mM, Sigma-Aldrich), tripsina (0,25%), glutamina (200 nM), penicilina G (100 U/ml), estreptomicina (100 ¼g/ml), fungisona (0,25 ¼g/ml), gentamicina (50 ¼g/ml).Cultura primária de micróglia: As culturas primárias de micróglia serão obtidas do encéfalo total de camundongos recém-nascidos de forma asséptica, conforme previamente descrito(76). As células coletadas serão adicionadas (105 células/ 500 ¼l) em placas de 24 poços revestidas com poli-l-lisina. Após 48h, as células serão lavadas com meio DMEM livre de soro e suplementado com antibióticos, contendo os tratamentos experimentais a serem investigados. Obtenção de vesículas extracelulares (VEs): As VEs serão isoladas e processadas conforme descrito(73). As culturas primárias de micróglia serão expostas a meio de cultura livre de soro por 10 min e o meio será coletado para quantificar produção constitutiva de VEs. A seguir, as culturas a serem estimuladas com ATP (para ativação do inflamassoma de NLRP3) serão incubadas primeiramente com LPS (4-6h). Todas as culturas serão mantidas em meio completo antes da adição de ATP ou capsaicina (1h). As VEs (exossomos) serão isoladas utilizando um kit comercial (Invitrogen, Thermo). Os exossomos serão submetidos à técnica de Western blotting para verificar a pureza dos exossomos obtidos através da detecção dos níveis de CD63, CD9 e Tsg101 (enriquecidos em exossomos), conforme descrito em (78). O RNA total será purificado das amostras de exossomos utilizando o kit comercial Total Exosome RNA Isolation Kit (Invitrogen, Thermo). Serão determinados os níveis do mRNA de IL-1², HDAC2, DNMTs 3a e 3b, CB1, CB2, TRPV1, FAAH. Beta-actina, GAPDH e serão utilizados como controles endógenos. Uma fração das VEs obtidas será congelada à -80oC para extração de lipídeos pelo método clorofórmio: etanol (2:1, v/v) e detecção dos níveis de ECBs (AEA e 2-AG) por cromatografia líquida acoplada à espectrofotômetro de massa, conforme descrito na literatura (77).Cultura primária de neurônios hipocampais e corticais: Será realizado conforme descrito(59). As células (5x105 células/cm2) obtidas serão colocadas em placas revestidas com poli-l-lisina e laminina e mantidas em meio suplementado até o momento do uso (7-12 dias). Culturas primárias serão incubadas com as VEs ou apenas com meio de cultura. Após o período de incubação, as células serão lavadas, os neurônios coletados e processados para obtenção de sinaptoneurossomas. Culturas independentes (1,6 x 105 células) serão utilizadas para os experimentos de co-cultura. Obtenção de sinaptoneurossomas: Para verificar a alteração na expressão de moléculas no terminal sináptico pelas VEs, os sinaptoneurossomos serão isolados conforme descrito(77). O RNAm e proteínas serão obtidos a fim de determinar a expressão de DNMTs, HDAC2, caspase-1, IL-1RI, proteínas associadas ao IL-1RI (IL-1RacP, MyD88, IRAK), PKC, TRPV1 total e fosforilado, CB1, CB2, FAAH, NAPE-PLD e DGL5ü(36, 59, 69). Para investigar a possibilidade de alterações pós-sinápticas na neurotransmissão glutamatérgica induzidas pelas VEs, os níveis das subunidades GluR1 e GluR2 dos receptores AMPA serão determinados, bem como das subunidades NR1 e NR2 dos receptores NMDA do glutamato. (AU)