Enzymatic alterations due to skeletal muscle ischemia in rats
Acta Cir. Bras. vol.15 n.3 São Paulo July/Aug./Sept. 2000
http://dx.doi.org/10.1590/S0102-86502000000300002
ALTERAÇÕES ENZIMÁTICAS DECORRENTES DE ISQUEMIA MUSCULAR ESQUELÉTICA EM RATOS1
Jorge Fonseca Ely2
Pedro Bins Ely3
Ronaldo Scholze Webster4
Michel Pavelecini5
Márcio Lucas6
Ely JF, Ely PB, Webster RS, Pavelecini M, Lucas M. Alterações enzimáticas decorrentes de isquemia muscular esquelética em ratos. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Jul-Sept;15(3). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.
RESUMO: Os autores estudaram as alterações enzimáticas [transaminase oxalo-acética (TGO), creatinofosfoquinase (CPK) e desidrogenase lática (LDH)] decorrentes de isquemia muscular esquelética em ratos submetidos à isquemia de membro inferior por 0, 2, 4 e 6 horas. Vinte e oito ratos Wistar foram divididos em 4 grupos: Grupo I (controle); e Grupos II, III, e IV (isquemia por 2, 4 e 6 horas, respectivamente). Após o período de isquemia, foi coletado sangue do plexo retrocular para análise laboratorial. Os valores obtidos (média±desvio padrão) para TGO nos Grupos I, II, III e IV foram, respectivamente: 20,14±6,76; 59,71±28,91; 88,28±11,17 e 123±52,65 U/l. Para CPK, os valores foram: 67,85±62,76; 203±108,71; 237,71±95,06 e 291,71±173,19 U/l. Para LDH, obteve-se: 334,14±117,13; 414,42±222,47; 526±234,75 e 427,57±273,58 U/l. Para análise estatística, utilizou-se o método de ANOVA, seguido do teste t de Bonferroni (p<0,05). Os níveis de TGO foram significativamente superiores nos grupos III e IV quando comparados ao controle. Para CPK, houve distinção significativa entre os grupos IV e I. Os níveis de LDH não se demonstraram estatisticamente diferentes entre os grupos. Os autores concluem que em períodos de isquemia por 2, 4 e 6 horas, a dosagem de LDH não se mostra um parâmetro útil na avaliação de dano muscular esquético. A TGO e CPK tiveram alterações significativas a partir de 4 e 6 horas, respectivamente, mostrando-se úteis na avaliação de isquemia muscular em ratos.
DESCRITORES: Isquemia. Músculo esquelético. Microcirurgia. Enzimas. Ratos.
O músculo esquelético é um tecido que incorpora várias substâncias bioquímicas em sua estrutura complexa. Sendo altamente vulnerável à anóxia, o músculo pode reagir à mesma pela liberação na circulação de muitas destas substâncias. Fisiologicamente, as substâncias químicas que determinam a energia do músculo são a adenosinatrifosfato (ATP) e a fosfocreatinina. Embora participantes desse processo fisiológico, essas substâncias tem um papel importante nas alterações bioquímicas que ocorrem durante a isquemia muscular1,2,3.
Do ponto de vista morfológico, a membrana da fibra muscular tem um papel essencial nas condições fisiopatológicas do músculo esquelético. Assim, as complicações metabólicas resultantes da isquemia muscular decorrem de um desarranjo dos processos de transporte transmembrana, que são responsáveis pela manutenção das várias substâncias bioquímicas nos diferentes meios intra e extracelular1,3.
Durante a isquemia muscular, a integridade fisiológica das membranas pode ser afetada por uma diminuição de ATP, cujo nível marcadamente reduzido no músculo isquêmico leva à mudanças na sua permeabilidade devido a reações de lipoperoxidação das mesmas, provocadas por radicais livres de oxigênio4.
Várias alterações metabólicas ocorrem durante a isquemia muscular, as quais podem ser passageiras ou prolongadas. São observadas, entre outras, alterações hidroeletrolíticas e enzimáticas, decorrentes da liberação do conteúdo de células danificadas dentro da circulação sistêmica. As alterações enzimáticas têm importância clínica e experimental, visto que a sua análise pode ser um parâmetro para se estimar a viabilidade muscular3.
O objetivo do presente trabalho é estudar as alterações das enzimas que mostram dano muscular [transaminase oxalo-acética (TGO), creatinofosfoquinase (CPK) e desidrogenase lática (LDH)], presentes na circulação sistêmica de ratos submetidos à isquemia de membro inferior em períodos diferentes.
Foram utilizados 28 ratos Wistar, com peso variando entre 250 e 350g, criados no Biotério da Disciplina de Farmacologia e Toxicologia da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA), os quais foram mantidos em condições controladas de luz (ciclo claro das 7 às 19 horas) e temperatura (22±2°C), recebendo ração padronizada e água ad libitum até 12 horas antes dos procedimentos. O estudo foi realizado de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de ética da Instituição para o uso e cuidados com animais de laboratório.
Os animais foram distribuídos em 4 grupos (n= 7 para cada grupo):
Grupo I (controle): os animais foram submetidos à indução anestésica, abordagem cirúrgica da região inguinal esquerda e dissecção dos vasos femorais, sem qualquer interrupção ao fluxo sangüíneo com posterior coleta de sangue para a análise bioquímica;
Grupos II, III e IV: animais submetidos à anestesia, abordagem cirúrgica da região inguinal esquerda, dissecção dos vasos femorais e ligadura proximal da artéria femoral profunda mantendo-se, desta forma, o membro inferior em isquemia por 2, 4 e 6 horas, respectivamente.
Após os procedimentos, todos os ratos foram sacrificados em câmara de CO2.
Realizou-se a pesagem do animal, colocando-os em decúbito dorsal; posicionamento de campos cirúrgicos; injeção intraperitoneal de solução de tiopental sódico a 50mg/ml (50 mg/kg), seguido de doses de manutenção conforme necessário. Fez-se a abordagem cirúrgica da região inguinal esquerda, dissecção dos vasos femorais com o auxílio de microscópio cirúrgico e conseqüente ligadura proximal da artéria femoral profunda esquerda utilizando-se fio prolene 7-0. Observou-se o animal por diferentes períodos ( 0, 2, 4 e 6 horas), conforme o grupo, sendo feita, a seguir, coleta de sangue do plexo retrocular com tubo capilar adequado e envio ao Laboratório de Análises Bioquímicas da Santa Casa de Porto Alegre para análise das enzimas CPK, LDH e TGO através de método colorimétrico. Após os procedimentos, realizou-se a síntese de pele dos animais com fio monofilamentar 4.0. A figura 1 retrata um momento do procedimento cirúrgico.
Figura 1. Abordagem da região inguinal esquerda com exposicão do nervo e vasos femorais em rato.
Pinças microvasculares no. 5 e 3; tesouras de dissecção microcirúrgica curva; tesouras de corte microcirúrgica reta; campos estéreis descartáveis; anteparo para o animal, afastadores, seringas, kits para coleta de sangue, fios prolene 7-0 para a ligadura dos vasos. Na dissecção dos vasos, utilizou-se microscópio cirúrgico.
Os dados coletados foram organizados em banco de dados (planilhas), por animal e por grupo de animais. Foram calculados a média e o desvio-padrão, sendo realizada análise estatística através do teste de ANOVA seguido pelo teste t de Bonferroni, considerando-se p<0,05.
Os resultados obtidos para TGO, LDH e CPK estão expressos na tabela 1.
De acordo com a análise estatística, os níveis de TGO foram significativamente superiores nos Grupos III e IV quando comparados ao grupo controle (p<0,05). Para CPK, houve distinção significativa entre os Grupos IV e I (291,71±173,19 vs 67,85±62,76; p<0,05). Os níveis de LDH não se demonstraram estatisticamente diferentes entre os grupos (p>0,05).
A creatinofosfoquinase (CPK) é uma enzima encontrada em alta concentração no músculo esquelético, miocárdio e cérebro. Seus níveis aumentam proporcionalmente com o desenvolvimento de alterações musculares degenerativas (1). Alguns autores evidenciaram que os níveis de CPK se elevam significativamente após 2 horas de isquemia muscular (5). Altos valores desta enzima usualmente refletem necrose muscular avançada. Conforme outros estudos experimentais, a CPK desaparece muito mais lentamente que outros metabólitos séricos como a mioglobina. Em casos de isquemia moderada, as concentrações séricas de CPK podem-se elevar a 1000 ou 2000 UI/l, retornando a níveis normais 10 a 12 dias após a revascularização (1). No rato, os níveis normais médios encontram-se na faixa de 50 UI/litro (6).
A desidrogenase lática (LDH) é encontrada principalmente no miocárdio, rim, fígado e músculo esquelético. Os valores normais no rato variam amplamente, dependendo da técnica utilizada, não havendo fórmula confiável para conversão dos dados de um método para outro. Pelo método colorimétrico de Babson e Philips, a média normal é de 15 UI/l (6).
A transaminase glutâmico-oxaloacético (TGO) é encontrada em alta concentração no miocárdio, fígado, músculo esquelético, rim e cérebro. Em virtude de sua ampla distribuição, a TGO não tem sido rotineiramente utilizada como parâmetro laboratorial em ratos (7, 8). Seus valores normais não diferem significativamente com a idade ou sexo dos animais, sendo levemente aumentados em relação aos valores humanos (6). Seus níveis elevam-se em qualquer forma de oclusão arterial aguda, estando aumentados em proporção ao grau de isquemia (1). Em casos de dano muscular severo, a persistência de altos níveis de TGO indica dano tecidual irreversível (2).
No presente estudo, os valores médios de TGO e CPK do Grupo I (controle) demonstraram-se semelhantes às encontradas na literatura, sendo a LDH não confiavelmente comparável em virtude da ampla variação entre os métodos utilizados (4, 7, 8). A simples observação das curvas enzimáticas construídas com as médias obtidas mostram-se progressivamente crescentes conforme aumenta o tempo de isquemia, confirmando a liberação de substâncias intracelulares na circulação e corroborando com estudos semelhantes presentes na literatura (1, 7, 8, 9). Contudo, após análise estatística, houve diferença significativa em relação ao grupo controle apenas nas dosagens de TGO e CPK, a partir de 4 e 6 horas de isquemia muscular, respectivamente. Conforme já descrito nos resultados, os níveis de LDH não se demonstraram estatisticamente diferentes entre os grupos. Os níveis de TGO foram significativamente superiores nos Grupos III e IV quando comparados ao Grupo I (controle). Para CPK, houve diferença significante entre os Grupos IV e I.
Em estudos posteriores, poderá-se correlacionar as alterações enzimáticas com os achados histopatológicos, bem como a atividade de mediadores de lesão tecidual, tais como os radicais livres de oxigênio.
As dosagens de TGO e CPK são úteis na avaliação de isquemia muscular de membros inferiores em ratos a partir de 4 e 6 horas, respectivamente.
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Ely JF, Ely PB, Webster RS, Pavelecini M, Lucas M. Enzymatic alterations due to skeletal muscle ischemia in rats. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Jul-Sept;15(3). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.
ABSTRACT: The authors studied the enzymatic alterations (CPK, TGO, e LDH) due to skeletal muscle damage in rats submitted to inferior limb ischemia for 0, 2, 4 and 6 hours. Twenty eight rats were divided into four groups: Group I (control), and Groups II, III and IV (ischemia for 2, 4 and 6 hours, respectively). A blood sample was drawn of the retrocular venous plexus after the ischemia period in all animals. The values obtained (mean±standard deviation) for TGO in Groups I, II, III and IV were, respectively: 20,14±6,76; 59,71±28,91; 88,28±11,17 e 123±52,65 U/l. The values for CPK were: 67,85±62,76; 203±108,71; 237,71±95,06 e 291,71±173,19 U/l. For LDH, we obtained: 414,42±222,47; 526±234,75 e 427,57±273,58 U/l. For the statistical analysis, we used the ANOVA method followed by the Bonferroni's t test (p<0,05). TGO levels obtained were statistically elevated in the Groups III and IV when compared to the control group. For CPK, there were significant difference between the groups IV and I. LDH levels there were not statisticantly different between the groups. The authors conclude which, after 2, 4 and 6 hours of ischemia, the LDH dosage was not an useful parameter in the prediction of muscle damage. TGO and CPK measures were altered significantly after 4 and 6 hours, respectively being useful in the evaluation of muscle ischemia in rats.
SUBJECT HEADINGS: Ischemia. Muscle, skeletal. Microsurgery. Enzymes. Rats.
Ronaldo Scholze Webster
Rua Antão de Farias, 99/402
Porto Alegre – RS
90035-210
Data do recebimento: 06/02/2000
Data da revisão: 23/03/2000
Data da aprovação: 12/04/2000
1. Trabalho realizado pela Disciplina de Cirurgia Plástica da Fundação Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA)/ Serviço de Cirurgia Plástica do Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre (CHSCPA).
2. Professor Titular da Disciplina de Cirurgia Plástica da FFFCMPA. Chefe do Serviço de Cirurgia Plástica da ISCMPA.