Contamination of peanut seeds inoculated with Aspergillus section Flavi affected by genotype, cultivation area and isolate
http://dx.doi.org/10.1590/S1413-70542010000400009
Contaminação de sementes de amendoim, inoculadas por Aspergillus secção Flavi, influenciada pelo genótipo, pela área de cultivo e pelos isolados
Eusinia Louzada PereiraI; Camila Santos BarrosI; Claudia Antonia Vieira RossettoII
IUniversidade Federal Rural do Rio de Janeiro/UFRRJ - Rio de Janeiro, RJ
IIUniversidade Federal Rural do Rio de Janeiro/UFRRJ - Departamento de Fitotecnia - Rodovia Antiga Rio São Paulo - Km 47 - Cx P. 74511 - 22890000 - Seropedica, RJ - cavrosse@ufrrj.br
Termos para indexação: Arachis hypogaea L., calagem, sanidade, viabilidade.
Index terms: Arachis hypogaea L., sanitary quality, liming, viability.
A ocorrência de podridões de sementes e tombamentos de plântulas é frequente na cultura do amendoim (Arachis hypogaea L). Nessas sementes, mais de 100 espécies de fungos têm sido identificadas, sendo muito delas responsáveis por perdas elevadas na cultura (Bellentini et al., 2005).
O amendoim pode ser contaminado no solo (Rossetto et al., 2003; Horn, 2005), como também após a colheita, durante o processo de secagem e no armazenamento (Usberti & Amaral, 1999), principalmente por espécies de Aspergillus pertencentes à secção Flavi, que pode reduzir a germinação bem como causar a morte do embrião, ou seja, que estão relacionadas à deterioração das sementes (Lima & Araujo, 1999; Brhattacharya & Raha, 2002).
Atualmente, vêm sendo selecionados genótipos de amendoim, visando evitar ou inibir a contaminação das sementes por esses fungos (Liang et al., 2005), tendo em vista que a semente é um dos componentes que vem impulsionando o aumento do custo de produção dessa espécie (Martins, 2008). Para Mehan et al. (1981), há diferenças potenciais entre os genótipos de amendoim quanto à invasão por Aspergillus flavus, bem como entre as estirpes de A. flavus quanto à virulência entre os genótipos.
Mixon & Rogers (1973) verificaram que a inoculação de sementes de amendoim em solução de esporos, com duas distintas estirpes de A. flavus, proporcionou diferenciação na resistência das sementes, provavelmente, devido ao fato das sementes com tegumento intacto serem mais resistentes. Também Vasedeva et al. (1989) comentaram que, em relação ao tegumento, deve-se considerar os fatores específicos que estão associados, tais como, uniformidade da camada cerosa, presença de taninos, compostos inibidores, acúmulo de cera na superfície, entre outros. Prado et al. (1999) ressaltaram ainda, que além do conhecimento dos mecanismos indutores de resistência, é necessário considerar as variações em função do isolado de A. flavus utilizado, seu potencial infectivo, o processo de inoculação, bem como também das condições de cultivo e colheita dos frutos a serem analisados (Usberti & Amaral, 1999).
Com o intuito de evitar-se a contaminação tem sido recomendada a utilização de cálcio, na forma de calcário quando esse é usado como corretivo de solo para as plantas mães. Esse nutriente é importante elemento que compõe a parede celular vegetal. Sementes oriundas de solos com teores adequados de cálcio apresentam maior espessura do tegumento e da parede celular da exotesta, o que resulta em menor perda de água (Fernandez et al., 1997). No entanto, Rossetto et al. (2003) não constataram efeito significativo da calagem na redução da incidência do grupo A. flavus, em sementes de amendoim do genótipo Botutatu.
Objetivou-se, neste trabalho avaliar a contaminação de sementes de amendoim inoculadas por A. secção Flavi, sob influência de diferentes genótipos produzidos em áreas de cultivo com e sem calagem e de distintos isolados utilizados.
O experimento foi conduzido na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, em 2005, utilizando-se três genótipos de amendoim (IAC 22, BR 1 e Caiapó) cultivados em Planossolo, submetidos ou não à aplicação de calcário dolomítico (1,2t.ha-1), designados de área de cultivo 1 e área de cultivo 2, respectivamente. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial: 3 (genótipos: IAC 22, BR 1 e Caiapó) x 4 (tratamentos: sem inoculação e três isolados de Aspergillus secção Flavi) x 2 (áreas de cultivo: 1- área com calagem e 2- área sem calagem), com quatro repetições.
Por tratamento, amostras de 304 sementes foram submetidas ou não ao procedimento de inoculação pelo método da imersão (Lima et al., 1984). Assim para a inoculação, as sementes foram imersas por cinco minutos em três distintas soluções, contendo isolado de Aspergillus secção Flavi (Takahashi et al., 2002), que corresponde ao grupo Aspergillus flavus, de acordo com a revisão apresentada por Abarca (2000), sem considerar a distinção entre A. flavus e de A. parasiticus (Klich & Pitt, 1988), na concentração de 5x104 esporos/ml. Foram selecionadas estirpes de A secção Flavi isoladas de sementes de amendoim do genótipo Botutatu, produzidas em 2001 em Seropédica/RJ (Viegas, 2004) e denominadas de I, II e II.
Para a inoculação, os fungos foram mantidos em placas de Petri de 9 cm de diâmetro contendo meio Batata Dextrose-Agar (BDA), que foram mantidas em câmara regulada a 25ºC e regime de 12 horas de luz, por sete dias (Berjak, 1984).
Após a inoculação e secagem sob fluxo laminar por 21 horas, as sementes foram divididas em duas amostras, sendo uma delas submetida à avaliação após a inoculação e a outra após o armazenamento durante 75 dias em câmara regulada a 18ºC e 45 % de UR do ar. Primeiramente foi realizada a determinação do grau de umidade, com quatro subamostras de 25 sementes (Brasil, 1992) e, em seguida, a instalação dos testes de sanidade, utilizando-se o método do plaqueamento direto e o de sintomas nas plântulas.
Pelo método de plaqueamento direto, oito subamostras de 13 sementes foram semeadas em meio BDA, acrescido de NaCl (6%) em placas de Petri de 9 cm de diâmetro e mantidas a 20ºC e 12 horas de luz, por sete dias (Araújo et al., 2004). Após a incubação, para a caracterização dos isolados pertencentes à A. secção Flavi, empregou-se o meio diferencial de Aspergillus (ADM), com base em Bothast & Fennell (1974). Por tratamento, os isolados foram incubados por 72 horas a 25ºC, na ausência de luz. A presença de pigmentação laranja-amarela no verso da colônia indicou reação positiva, isso é, que o isolado pertence à A. secção Flavi. A caracterização e a identificação das outras espécies do gênero Aspergillus foi realizada com base na taxonomia usada por Pitt & Hocking (1997), empregando-se os meios de cultura czapeck-ágar-extrato de levedura (CYA) e Agar-extrato de malte (MEA). Além disso, também foi realizada a identificação dos fungos tais como do gênero Penicillium, Rhizopus e Fusarium, com base em Silveira (1981) e Singh et al. (1992).
Pelo método de sintomas em plântulas, quatro subamostras de 25 sementes foram semeadas a 2 cm de profundidade em bandejas de plástico contendo areia lavada, esterilizada e umedecida com água destilada a 60% da capacidade de retenção de água (Brasil, 1992). As caixas foram mantidas em condições de ambiente sob temperatura média de 25ºC e UR do ar média de 64%. As contagens foram efetuadas aos cinco e 10 dias após a instalação (Brasil, 1992), considerando-se a porcentagem de plântulas normais (sadias com, no mínimo, 6 cm de comprimento), de plântulas deterioradas (com suas estruturas essenciais deterioradas em decorrência da infecção primária, impedindo o desenvolvimento normal), e de sementes mortas pelo intenso crescimento de fungos.
Os dados coletados nas avaliações foram submetidos à verificação de normalidade e de homogeneidade dos erros da variância, para verificar a necessidade de transformação (Ribeiro Júnior, 2001). Posteriormente, foi feita a análise de variância individual e a avaliação da relação entre o maior e o menor quadrado médio do erro, para realizar a análise conjunta dos dados (Gomes, 1990). As comparações entre médias foram feitas pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
Após a análise de variância conjunta, foi observado tanto na avaliação após a inoculação como na realizada após 75 dias de armazenamento, que não houve efeito da interação tripla entre genótipos de amendoim, áreas de cultivo da semente (com ou sem calagem) e isolados de A. secção Flavi, para nenhum dos parâmetros analisados (Tabelas 1 e 2).
Na Tabela 1, na avaliação realizada após a inoculação, foi constatado efeito da interação entre isolados e genótipos para porcentagem de plântulas normais, obtidas no teste de sintomas de plântulas, bem como para porcentagem de fungos total e dos pertencentes A. secção Flavi, após o método do plaqueamento direto e para teor de água das sementes. Independente da área de cultivo das sementes, houve maior porcentagem de plântulas normais sadias provenientes de sementes inoculadas com os três isolados, do que das não inoculadas, ainda que, em média, 97% dessas sementes inoculadas apresentavam-se com fungos, sendo 93% desses fungos pertencentes A. secção Flavi (Tabela 1) e 7% a outras espécies de Aspergillus, bem como por outros gêneros (Penicillium, Fusarium e Rhizopus) (dados não apresentados). Também, Mixon & Rogers (1973) constataram elevada incidência de A. flavus em sementes de amendoim após inoculação em suspensão de esporos, sendo que a porcentagem de sementes contaminadas variou conforme o genótipo. No entanto, para Brhattacharya & Raha (2002) e Bellenttini et al. (2005), as espécies de Aspergillus podem ser responsáveis pela redução da germinação, provocando tombamento de plântulas, bem como seu efeito na deterioração das sementes.Estes resultados de aumento da porcentagem de plântulas normais provenientes de sementes inoculadas, provavelmente, possam estar relacionados com a ausência de ferimentos das sementes, pois as sementes que foram utilizadas aparentemente apresentavam-se intactas. Também Horn (2005) constatou que o ferimento das sementes tem sido requerido para alta colonização fúngica por A. secção Flavi. Esses resultados podem estar relacionados ao próprio procedimento de inoculação, uma vez que a imersão das sementes em suspensão de esporos pode ter promovido o início do processo de germinação, segundo o princípio da técnica de condicionamento fisiológico (Heydecker et al., 1975).Ou seja, com o aumento do teor de água, após a absorção de água pelas sementes imersas em suspensão de esporos, de 7,75% para valores, em média, de 10,12% (Tabela 1), houve a inicialização do processo de germinação, com ativação enzimática e reparo metabólico, favorecendo a qualidade fisiológica das sementes. Araújo & Rossetto (2005) também observaram efeito favorável do condicionamento fisiológico, pela técnica de hidratação controlada na germinação das sementes de amendoim.
Na Tabela 1, após a inoculação, verificou-se que, independente da área de cultivo das sementes, houve menor porcentagem de plântulas normais obtidas de sementes dos genótipos IAC 22 inoculadas com os isolados I e II e do genótipo BR1 inoculadas com o isolado III, após o método do plaqueamento direto. Esse resultado, provavelmente, está relacionado com o maior conteúdo de água dessas sementes (Tabela 1). Para Bashra et al. (1984), quanto menor o conteúdo de água das sementes, menor a capacidade de produção de fitoalexinas, que são compostos antimicrobianos produzidos pelas plantas em resposta à invasão de certos patógenos, o que resulta em atividade fúngica.
Na avaliação após o armazenamento, apenas houve efeito significativo de isolados para porcentagens de sementes contaminadas por fungos (total) e por A. secção Flavi, identificados no método do plaqueamento direto, bem como para porcentagem de sementes mortas, obtidas no teste de sintomas de plântulas. Assim, as sementes inoculadas apresentaram as maiores porcentagens de fungos, principalmente de A. secção Flavi e de sementes mortas do que as não inoculadas. Já para plântulas normais e para teor de água das sementes, que esteve em torno de 5,56%, não houve efeito dos tratamentos (Tabela 1). Esses resultados podem estar relacionados ao equilíbrio higroscópio das sementes durante o armazenamento, que não interferiu na infecção por fungos e na porcentagem de plântulas normais sadias, ou seja na deterioração das sementes. De acordo com Bruno et al. (2000), a prevenção da contaminação por fungos durante o armazenamento ocorre quando a umidade relativa do ar é baixa e, consequentemente, o teor de água das sementes é menor, sendo ideais os valores abaixo de 7% de água para a manutenção da viabilidade da semente.
Pela tabela 2, na avaliação realizada após inoculação, foi constatado efeito da interação genótipo e área de cultivo das sementes para porcentagem de plântulas anormais deterioradas, obtidas no teste de sintomas de plântulas. Assim com a utilização dos três isolados para a inoculação, houve menor porcentagem de plântulas anormais deterioradas obtidas de sementes do genótipo IAC 22, provenientes da área de cultivo designada como 1 do que das provenientes da área de cultivo 2. Pelo histórico de produção, essas sementes foram provenientes de área com calagem, após terem sido colhidas aos 120 dias após a semeadura, período considerável como favorável à obtenção de sementes com máxima qualidade fisiológica, de tal forma que essas características poderiam dificultar ou impedir a infecção por fungos do grupo A. flavus (Rossetto et al., 2004 ). Para Fernandez et al. (1997), há efeito favorável da aplicação de calcário na redução da invasão por A. flavus, provavelmente devido ao aumento de cálcio nas sementes, tornando o tegumento mais espesso, sendo que esses resultados também foram constatados por Small et al. (1989).
Pela Tabela 2, verificou-se que na avaliação realizada após o armazenamento, somente houve efeito significativo de isolados na porcentagem de plântulas anormais deterioradas, obtidas no método de sintomas em plântulas. Houve aumento da porcentagem de plântulas anormais deterioradas provenientes de sementes inoculadas do que as não inoculadas, sugerindo que, com a liberação de exsudados das sementes para o meio de hidratação, promovida após a hidratação das sementes durante a exposição à técnica de inoculação em suspensão de esporos, houve favorecimento da atividade de microrganismos. Esse resultado também pode estar relacionado ao fato de A. flavus ser agressivo, em relação ao processo de colonização e de infecção de amendoim, como também constatado por Pitt et al. (1991). Com a inoculação empregando a solução na concentração de 5x104 esporos/ml, os mesmos devem ter se estabelecido rapidamente, impedindo o desenvolvimento de outros fungos.
A. secção Flavi não reduziu a porcentagem de plântulas normais sadias, provenientes de sementes inoculadas dos diferentes genótipos de amendoim.
As sementes de amendoim do genótipo IAC 22, produzidas em área com calagem, promoveram a obtenção de menor porcentagem de plântulas anormais deterioradas.
Teores de água das sementes próximos a 5,6%, durante o armazenamento, não contribuíram para a infecção de A. secção Flavi e para a diminuição da porcentagem de plântulas normais.
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