O Mastino Napoletano é uma raça de cão muito antiga, sendo citado por grandes escritores e oradores da Roma antiga, mas apesar de diversas citações a este cão ao longo da história, sua origem ainda é bastante controversa e discutida por historiadores e cinófilos.
Alguns afirmam que ele seria descendente dos cães que Alexandre, o Grande, conheceu na Grécia e havia levado para Roma. Outros acreditam que a raça seja descendente direto dos molossos romanos, usados pelos exércitos romanos nas guerras contra seus inimigos e outros ainda afirmam que a raça tenha sido originada do cruzamento entre os molossos romanos e os Pugnaces Britannie, trazidos da Inglaterra pelos soldados romanos e por último existe a possibilidade de ter sido trazido ao Mediterrâneo em navios fenícios, há milênios.
Estas suposições têm em comum a crença de que o progenitor do Mastino seria um cão de características molossóicas que viveu no Tibete, mas a maioria dos estudiosos discordam desta linha de raciocínio e investigam o passado do Mastino em cães europeus. Porém, de maneira geral, todas as correntes acreditam que o Mastino colaborou para a constituição de muitas outras variedades de molossos, como o Rottweiler e o São Bernardo.
O tempo passou, mas o Mastino manteve suas características desenvolvidas na região da Campânia - Durante a 2ª Guerra Mundial, muitos exemplares morreram. Apesar da antigüidade, o Mastino Napoletano só foi reconhecido oficialmente como raça bem mais recentemente e esse feito deveu-se, especialmente, ao trabalho de seleção do escritor Piero Scanziani, que interessou-se pelos cães apresentados na 1ª Exposição Canina em Nápoles, onde ressurgiram oito belos espécimes da raça. Foi Piero quem iniciou um trabalho de seleção e em 1949, conseguiu junto ao E.N.C.I. (Ente Nazionale Cinofilo Italiano) o reconhecimento oficial da raça, cujo padrão definitivo foi fixado apenas em 1971.