Effect of structural features on the gelling process of high methoxyl pectins
Polímeros vol.9 no.3 São Carlos July/Sept. 1999
http://dx.doi.org/10.1590/S0104-14281999000300008
Influência de Fatores Estruturais no Processo de Gelificação de Pectinas de Alto Grau de Metoxilação
Edimir M. Brandão e Cristina T. Andrade
RESUMO: Duas amostras de pectina de alto grau de metoxilação, amostras A e B, foram purificadas, levando-se em conta os teores em grupos metoxílicos. Sua caracterização estrutural foi realizada através de dosagem de açúcares neutros com auxílio de cromatografia gasosa, GLC, e determinação do grau de metoxilação por técnicas de cromatografia líquida de alta resolução, HPLC. A amostra A apresentou teores mais elevados em açúcares neutros totais e grau de metoxilação mais alto. As viscosidades intrínsecas, [h] = 3,68 dL/g e [h] = 3,56 dL/g foram determinadas a pH 7,0 para as amostras A e B, respectivamente. A pH 3,0, valores menores foram obtidos. A gelificação das amostras foi investigada, em função da concentração e da temperatura, medindo-se os módulos de armazenamento, G', e de perda, G", em função do tempo. A pH 3,0 a pectina A apresentou taxas de gelificação mais elevadas, tanto em função da concentração como da temperatura.
Palavras-chave: Pectina, grau de metoxilação, gelificação
ABSTRACT: Two pectin samples A and B with high methoxyl content were purified, taking into account their contents in methoxylic and carboxylic acid groups. Their chemical compositions were investigated by analysis of neutral sugars by gas chromatography and determination of the degree of methoxylation by high performance liquid chromathography. For sample A, a higher content in total neutral sugars and a higher degree of methoxylation were determined. Intrinsic viscosities, [h] = 3.68 dL/g and [h] = 3.56 dL/g, were determined at pH 7.0 for samples A and B, respectively. At pH 3.0, lower values were determined. Gelation was investigated in relation to sample concentration and temperature, measuring the storage modulus, G', and loss modulus, G", as a function of time. At pH 3.0, pectin A showed higher rates of gelation, as a function of both concentration and temperature.
Keywords: Pectin, degree of methoxylation, gelation.
As pectinas, polissacarídeos estruturais, formam um grupo complexo de polissacarídeos que são encontrados na parede celular primária e nas camadas intercelulares de plantas terrestres. Elas estão associadas à celulose, hemicelulose e lignina[1-3] e são mais abundantes em frutos e em tecidos jovens, tais como cascas de frutas cítricas (30%), dentre as quais o limão é a fonte mais abundante[1,4].
As pectinas contribuem para a adesão entre as células e para a resistência mecânica da parede celular[1-3]. Além de seu papel importante no crescimento das células[5], elas estão envolvidas em interações com agentes patogênicos, e a sua quantidade e natureza são determinantes para a textura de frutos e vegetais em geral, durante o seu crescimento, amadurecimento, armazenamento e processamento[6].
Estruturalmente, as moléculas de pectina são constituídas de uma cadeia principal linear de unidades repetidas de (1®4)-a-D-ácido galacturônico, sendo que parte destas unidades apresenta-se esterificada, como éster metílico (Figura 1). As cadeias de resíduos galacturonato são, porém, interrompidas por unidades de (1®2)-a-L-ramnose, às quais estão ligadas cadeias laterais, formadas por açúcares neutros. Essas cadeias laterais são responsáveis pela união das moléculas de pectina à matriz polissacarídica da parede celular vegetal[2,7,8]. Embora o ácido D-galacturônico seja o principal açúcar constituinte das substâncias pécticas em geral, proporções variáveis de outros açúcares, tais como D-galactose, L-arabinose, D-xilose, Lramnose, L-fucose e traços de 2-O-metilfucose também podem ser encontrados[8-10].
Genericamente, as pectinas são subdivididas em duas classes, uma com alto grau de metoxilação (>50%), HMP, e a outra com baixo grau de metoxilação (<50%), LMP, que pode também possuir grupos amida. Comercialmente, as pectinas com alto grau de metoxilação apresentam teores na faixa 55 a 75%, já nas de baixo grau de metoxilação, esses teores variam na faixa 15 a 45%. Quando amidadas, as pectinas de baixo teor em grupamentos metoxílicos apresentam composição em grupamentos amida[11] na faixa 10 a 25%.
As HMP possuem considerável poder gelificante e são amplamente usadas na gelificação de sucos de frutas para a obtenção de geléias[1]. A presença de cadeias laterais, principalmente com unidades de arabinose e galactose[8,12], afeta significativamente as propriedades funcionais das pectinas, tais como solubilidade, gelificação, formação de filme e propriedades reológicas, além de favorecer a agregação em soluções concentradas[8].
Pectinas com alto grau de metoxilação gelificam em meio ácido, em presença de altas concentrações de um co-soluto, geralmente sacarose. Este processo de gelificação é complexo, havendo, ainda, divergência sobre seu mecanismo[7,13,14].
As pectinas são polissacarídeos muito utilizados industrialmente, principalmente em produtos alimentícios, aos quais são adicionados em pequenas quantidades. O objetivo deste trabalho foi o de investigar as propriedades reológicas de pectinas de alto grau de metoxilação produzidas no Brasil. O processo de gelificação em presença de sacarose foi estudado através da variação dos parâmetros viscoelásticos na vizinhança de transição de fase sol-gel. Os resultados obtidos permitiram inferir sobre a hierarquia das forças de ligação envolvidas na formação do gel.
Duas amostras de pectina cítrica, denominadas pectinas A e B, fornecidas pela Braspectina (Limeira, SP), com alto teor em grupos metoxílicos e com diferentes graus de metoxilação foram utilizadas neste trabalho. Foram purificadas por meio de dissolução em água destilada e deionizada e filtração, sob pressão de 105 Pa de nitrogênio comprimido, através de membranas Millipore de 3 e 1,2 µm de diâmetro de poro. Após a filtração, a forma predominantemente sódica da pectina foi obtida por meio de troca iônica em solução de NaCl (levando-se em conta a fração molar pectina/grupos carboxílicos de 1:0,25 para a pectina A e de 1:0,35 para a pectina B). O polímero foi recuperado pela precipitação em álcool etílico, e seco sob pressão reduzida a temperatura ambiente.
A razão galacturonato de metila/ácido galacturônico ou grau de metoxilação, GM, das amostras A e B foi determinada após hidrólise ácida do polímero, e os monossacarídeos resultantes analisados por cromatografia líquida de alta eficiência, HPLC[15].
Os teores de açúcares neutros das amostras de pectina foram obtidos mediante hidrólise ácida, seguida de redução e posterior acetilação. A análise dos açúcares resultantes foi realizada por cromatografia gasosa, GLC[16], utilizando-se a arabinose como padrão interno. A hidrólise total das pectinas foi realizada em solução aquosa 2 M de ácido trifluoroacético, a 100°C, durante 3 h. O produto da hidrólise foi neutralizado com carbonato de bário. O produto de hidrólise era levado à secura, sob pressão reduzida, a 45°C. 200 µL de uma solução redutora de 2,5 mg/mL de NaBH4 em 0,5 M de NH4OH eram adicionados ao produto de hidrólise que, após homogeneização era deixado em repouso por 1 h a temperatura ambiente. Após esse período, as soluções eram neutralizadas com ácido acético e os produtos de redução levados à secura, sob pressão reduzida, a 45°C. 0,2 mL de uma mistura anidrido acético: 4-(dimetilamina)-piridina, na proporção 10:1, foi adicionado sobre o produto de redução e homogeneizado. Esta acetilação foi realizada a 100°C por um período de 1 h. Após repouso por 12 h, os alditóis acetilados foram extraídos com HCCl3.
Dois tipos de reômetros foram utilizados neste trabalho para a caracterização reológica das duas amostras; o reômetro Contraves Low-shear 40, LS40, e o reômetro Haake RheoStress, RS100. O LS40 permite a determinação de medidas de viscosidade e de propriedades viscoelásticas dentro de um regime de baixo cisalhamento. O RheoStress RS-100 é um reômetro rotacional de tensão controlada e que também segue o princípio de Couette em regime de cisalhamento alto. As soluções eram colocadas no sistema de medida e permaneciam em repouso por 10 min. antes da realização dos testes. Em todas as medidas realizadas sob temperatura superior a 25ºC, foi utilizado um sistema que mantinha a amostra encapsulada, evitando a evaporação do solvente.
Para a determinação das viscosidades intrínsecas das amostras, soluções-mãe das amostras de pectina a 2,0 g/L foram preparadas em 0,1 M de NaCl, a pH 3,0 e a pH 7,0 e filtradas em membranas Millipore de 0,45 µm de diâmetro de poro. Soluções diluídas em 0,1 M de NaCl, a pH 3,0 e a pH 7, foram analisadas sob cisalhamento contínuo em reômetro LS-40, equipado com geometria de cilindros coaxiais (MS-DIN 412), na faixa de taxa de cisalhamento, , correspondente ao platô newtoniano. As concentrações das soluções foram escolhidas de modo a fornecer viscosidades relativas entre 1,2 a 2,0, e garantir a extrapolação linear à concentração zero[17]. As equações de Huggins (Equação 1) e de Kraemer (Equação 2) foram utilizadas.
onde kH e kK são os coeficientes de Huggins e de Kraemer, respectivamente, e C é a concentração da solução, dada em g/dL.
A transição de fase sol-gel foi monitorada medindo-se os módulos de armazenamento, G', e de perda, G", a uma freqüência fixa de 0,464 Hz como uma função do tempo, no RheoStress RS-100, equipado com um sistema cone-placa (4°/35 mm).
Para o estudo da cinética de gelificação, a quantidade necessária de pectina era dispersa em água destilada e deionizada, aquecida a 95°C durante 5 minutos. Sob aquecimento e agitação constantes, a quantidade necessária de sacarose era adicionada em três porções e o sistema pectina-sacarose, a pH 3,0, era mantido a 95°C por um período de 15 minutos. A água perdida por evaporação era reposta e a amostra transferida para o sistema de medida do instrumento na temperatura da análise. O tempo decorrido desde o início do processo de aquecimento até o início da análise era de 18 minutos.
Os resultados de análise mostraram que a pectina A apresentou grau de metoxilação GM=64%, enquanto que na pectina B, GM=57%.
Na Tabela 1, são apresentados os teores de açúcares neutros e sua composição nas amostras das pectinas purificadas e analisadas por GLC. A pectina A contém um teor de açúcares neutros maior do que a pectina B (Tabela 1). Durante a extração da pectina, o processo mais utilizado produz pectina com grau de esterificação mais alto, geralmente entre 70 e 80%. Já as pectinas com menor grau de metoxilação são produzidas por desesterificação controlada de pectinas com alto grau de metoxilação, em meio ácido, básico ou enzimaticamente, sendo a desesterificação ácida a mais usada[11]. Portanto, a diferença nos teores e composição dos açúcares neutros das amostras de pectina estudadas pode ser atribuída a diferenças nas fontes da matéria-prima.
Analisando a composição dos açúcares neutros na Tabela 1, verifica-se que o teor de L-ramnose aumenta na amostra B, em relação à amostra A. Por outro lado, a fucose e a ribose não são detectados na amostra B. Ainda, o teor de manose aumenta e o de galactose diminui na amostra B, em relação à amostra A. Isto pode ser explicado pelo fato de a ligação glicosídica (1®2) entre o C-1 do ácido galacturônico e o C-2 da ramnose ser uma ligação resistente à hidrólise ácida[18,19], enquanto que as ligações dos outros açúcares neutros à ramnose são lábeis em meio ácido.
A Tabela 2 apresenta valores de viscosidade intrínseca, [h]. Pode-se verificar que esses valores a pH 7,0 são maiores do que a pH 3,0 para ambas as amostras. O valor mais baixo de [h] a pH 3,0 pode ser atribuído à contração da cadeia de pectina, um polieletrólito, devido à supressão de repulsões eletrostáticas intermoleculares e/ou a um aumento na interação segmentar intramolecular. Comparando os valores de [h] de ambas as pectinas a pH 7,0, a pectina B possui um valor menor, o que era inesperado, pois a pectina B possui um GM menor. A pH 3,0, os resultados estão concordantes com o esperado, pois em pectinas de alto grau de metoxilação a viscosidade das soluções geralmente aumenta com o grau de metoxilação crescente.
Testes preliminares mostraram que a concentração mínima de pectina que resultava em gel, em espaço de tempo relativamente curto, era de aproximadamente 3 g/L. O pH necessário para a formação desses géis foi testado na faixa de 2,0 a 3,5, sendo o pH 3,0 escolhido. A concentração de sacarose escolhida foi de 60% (em peso), após avaliações na faixa de 55 a 80% (em peso). Para estudar o sistema pectina/sacarose na transição de fase sol-gel foram escolhidas as concentrações de pectina na faixa de 3 a 10 g/L.
Na Figura 2 são apresentadas, como exemplos, as curvas que representam a evolução de G' e G" (a uma freqüência constante de 0,464 Hz) em função do tempo de gelificação e da concentração da pectina A (na faixa de concentração de 3 a 10 g/L) em presença de 60% de sacarose, a 25oC. Para ambos os polímeros, no início do processo de gelificação, o módulo de perda é maior que o módulo de armazenamento, G" > G', caracterizando um comportamento viscoso do sistema. Com a evolução do tempo, G' e G" aumentam, como conseqüência do aumento do número de zonas junção. O G' aumenta mais acentuadamente do que o G", e após a interseção das duas curvas, G' passa a exceder G".
O critério utilizado neste trabalho para determinar o ponto gel foi o tempo necessário para que G' e G" se igualassem, em uma dada freqüência[20,21]. Na verdade, a igualdade de G' e G" não deve ser considerada como uma propriedade universal do ponto gel, pois o tempo necessário para que a interseção de G' com G" ocorra pode ser muito próximo, mas não é idêntico ao tempo necessário para a transição de fase sol-gel. No entanto, esse critério é simples e vem sendo utilizado por muitos autores. Deve-se, porém, levar em conta que o momento de interseção de G' com G" depende da freqüência do experimento dinâmico e, portanto, não deve ser usado como um critério absoluto para a determinação do ponto gel[20,21].
Após a interseção de G' com G", G'continua tendo uma grande variação crescente, enquanto que o G" também aumenta, mas menos acentuadamente. Este aumento rápido de G' resulta da formação rápida de zonas de junção entre cadeias de pectina que formam a rede do gel.
Ainda na Figura 2, as curvas que representam G' como uma função do tempo, para diferentes concentrações de pectina A, mostram que com o aumento da concentração, a variação de G' é mais acentuada antes da transição de fase sol-gel. Entretanto, a concentrações mais baixas, G' aumenta mais lentamente seguido por um aumento relativamente mais acentuado. Além disso, o tempo necessário para o cruzamento de G' e G" aumenta com o decréscimo da concentração. Comportamento similar foi encontrado para outros biopolímeros[22,23] como por exemplo o sistema pectina de baixo grau de metoxilação/cálcio[24] .
A Figura 3 mostra que o tempo de transição de fase sol-gel, tg, diminui com o aumento de concentração de pectina, o que está de acordo com dados reportados na literatura[18]. Porém, para as pectinas A e B, os valores absolutos são diferentes. O perfil da curva tg (min) versus C (g/L) confirma que o grau de metoxilação é o fator intrínseco mais importante para a gelificação de amostras de HMP, controlando a taxa de formação das zonas de junção da rede durante o processo de gelificação[8, 25]. A transição de fase sol-gel para a pectina A que apresenta o maior grau de metoxilação é sempre mais rápida, para uma dada concentração, do que para a pectina B, em todas as concentrações estudadas. Geralmente, para as HMP, o tempo de gelificação é inversamente proporcional ao grau de esterificação[26].
O valor de G' no ponto gel é plotado como uma função da concentração para as pectinas A e B na Figura 4. A pectina A, além de necessitar de menor tempo para a transição, fornece valores de G' maiores do que aqueles da pectina B, em toda a faixa de concentração estudada. Provavelmente, o gel de pectina A possui um número maior de zonas de junção.
A investigação do processo de gelificação em sistemas HMP-sacarose tem mostrado que o tempo de gelificação apresenta uma dependência complexa com a temperatura[27,28]. As interações hidrofóbicas, eletrostáticas e ligações de hidrogênio contribuem para a formação e estabilização da rede do gel e essas interações são afetadas pela temperatura.
No presente trabalho, a formação do gel foi investigada em função da temperatura, medindo-se os valores de G' e de G" a uma freqüência fixa de 0,464 Hz, como uma função do tempo, para ambas as amostras de pectina, na concentração de 7 g/L. Como exemplo, a Figura 5 mostra os resultados obtidos para a pectina A. Tanto para esta pectina como para a pectina B, G' e G" aumentam em função do tempo, para todas as temperaturas estudadas. Pode-se observar que a taxa de variação dos módulos e o tempo de gelificação, tg, dependem da temperatura na qual o experimento foi realizado. A 15oC, a transição de fase sol-gel é mais lenta. A 25 oC, o valor de G' no ponto gel é maior do que aqueles obtidos sob as demais temperaturas.
Para ilustrar a influência da temperatura no processo de gelificação o gráfico da Figura 6 foi elaborado. Esta figura mostra a dependência do tempo de gelificação em função da temperatura, para as pectinas A e B. Nas faixas de temperatura de 15 a 25°C e de 15 a 35°C para as pectinas A e B, respectivamente, o tempo necessário para a transição de fase sol-gel decresce. Este resultado pode ser atribuído à contribuição crescente das interações hidrofóbicas à formação da rede tridimensional, com o aumento da temperatura. A pectina A sofre uma influência maior da temperatura por possuir maior grau de metoxilação.
Os resultados das Figuras 5 e 6 evidenciam que há uma temperatura ótima para o processo cinético de gelificação, a qual varia com o grau de metoxilação. Para a pectina A a temperatura ótima de gelificação fica em torno de 25°C e, para a pectina B, o tempo de transição de fase sol-gel atinge a estabilidade a partir de 28°C. A nível molecular, a temperatura ótima corresponde a um máximo da cooperação das interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio. Analisando a variação do tempo de gelificação com a temperatura, pode ser notado que, entre 15 e 25°C, ocorre um decréscimo acentuado no tempo de gelificação e que, na faixa de 30 a 40°C, o tempo de gelificação permanece praticamente constante. Entretanto, para a pectina A, na faixa de temperatura analisada, um comportamento interessante é observado. A partir de aproximadamente 25°C, o tempo de gelificação volta a aumentar e passa a exceder os valores obtidos para a pectina B no mesmo intervalo de temperatura.
Com base nos resultados experimentais obtidos no presente trabalho, ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas contribuem para formação da rede de HMP-sacarose. Essas ligações secundárias sofrem diferentemente o efeito da temperatura; enquanto que as ligações de hidrogênio são estabilizadas pelo abaixamento de temperatura, as ligações hidrofóbicas são formadas a temperaturas mais elevadas[13,14,27].
O método utilizado neste trabalho visava a obtenção de géis bem estruturados. Para tal, foi planejado o aquecimento inicial das soluções, para favorecer a formação de ligações hidrofóbicas e que levam a uma conformação macromolecular compacta.
Com o resfriamento, um número maior de ligações de hidrogênio serão formadas, tendo-se em vista a proximidade entre os sítios ativos.
Desta forma, a temperaturas inferiores a 30oC, a rede tridimensional é formada por uma maior cooperação entre ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas, e que necessitam de um período de tempo maior para a sua formação e que levam a estruturas mais fortes[14]. Por outro lado, com o aumento da temperatura, o ponto gel é caracterizado por rede tridimensional mais fraca, devido à menor contribuição de ligações de hidrogênio, e que se forma mais rapidamente devido à contribuição predominante de ligações hidrofóbicas[13,14].
A redução nos valores das viscosidades intrínsecas, observados a pH 3,0, indicam uma tendência à contração das cadeias de pectina em solução, através de ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas intramoleculares.
O grau de metoxilação mostrou ser o fator intrínseco mais importante para a gelificação de pectinas, uma vez que a transição de fase sol-gel para pectina A foi sempre mais rápida, pois em condições de baixo pH seqüências de cadeias esterificadas são capazes de formar associações estáveis a temperaturas mais altas e que são estabilizadas com o decréscimo da temperatura.
No ponto da transição de fase sol-gel, a pectina A apresentou valores de G' iguais a G" sempre maiores do que aqueles da pectina B, possivelmente por formar um número maior de zonas de junção.
O sistema pectina/sacarose mostrou ser bastante complexo durante o processo de gelificação em função da temperatura, com predominância de interações do tipo ligação de hidrogênio a baixas temperaturas e interações hidrofóbicas a temperaturas mais altas. Portanto, dependendo da temperatura, as zonas de junção são formadas e estabilizadas por contribuições diferentes de interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio, o que afeta a estrutura da rede e o comportamento viscoelástico no ponto de transição de fase sol-gel.
Em tempo relativamente curto, a temperatura ótima de gelificação pôde ser determinada para as amostras de pectina.
Os autores agradecem à Braspectina S.A. pelo fornecimento das amostras, ao CENPES/PETROBRAS pela utilização do Reômetro RS100 e à CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro.
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Recebido: 18/01/99
Aprovado: 27/09/99
Edimir M. Brandão e Cristina T. Andrade, Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Tecnologia, Bloco J, C.P. 68525, CEP:21945-970, Rio de Janeiro, RJ.