Avaliação funcional e histológica da oxigenoterapia hiperbárica em ratos com lesão medular
http://dx.doi.org/10.1590/S1413-78522011000100003
Paulo Eduardo de Carvalho Galvão; Alexandre Fogaça Cristante; Henrique Mennucci de Haidar Jorge; Marcelo Loquette Damasceno; Raphael Martus Marcon; Reginaldo Perillo Oliveira; Tarcísio Eloy Pessoa de Barros Filho
OBJETIVOS: Avaliar a eficácia da aplicação da oxigenoterapia hiperbárica em ratos Wistar, com lesão medular contusa produzida por equipamento computadorizado para impacto por queda de peso, NYU Impactor.
MÉTODOS: Avaliaram-se 17 ratos machos com peso variando de 265 a 426 g; realizaram-se impactos com peso de 10 g de uma altura pré-determinada de 12,5 mm ao nível da décima vértebra torácica, após realização de laminectomia prévia. Os ratos foram divididos aleatoriamente em grupo controle e grupo oxigênio hiperbárico. Este último, submetido à tratamento com oxigenoterapia em câmara hiperbárica, durante uma hora diária por um período de 30 dias. A avaliação da recuperação locomotora foi realizada no 2º, 9º, 16º, 23º e 30º dia pós-operatório, avaliados através de escala funcional e o sítio de lesão submetido à exame anatomopatológico.
RESULTADOS: Demonstrou-se melhora da recuperação locomotora nos ratos tratados com oxigênio hiperbárico nas fases iniciais de avaliação mas no final da avaliação não havia diferença estatisticamente significante entre ambos grupos. O exame anatomopatológico comprovou as alterações estruturais da medula espinal nos dois grupos.
CONCLUSÃO: A lesão medular leve provocada nos ratos evoluiu de maneira diferente no grupo da oxigenoterapia hiperbárica comparativamente ao grupo controle, na fase inicial.
Descritores: Oxigenação hiperbárica. Traumatismos da medular. Ratos Wistar.
A lesão medular é incapacitante, irreversível e de alto custo econômico e social. Caracteriza-se pela interrupção, parcial ou completa, das principais funções da medula espinal, ou seja, das funções motoras, sensitivas, reflexas e por provocar distúrbios neurovegetativos dos segmentos corporais localizados abaixo do nível da lesão. Tem como causa mais frequente o traumatismo, mas também é produzida por tumores,1 infecção ou lesão vascular.2
A lesão da medula espinal ocorre em geral em pacientes jovens, é mais frequente em homens e, dessas lesões, 70% são traumáticas. As causas mais comuns são os acidentes com veículos, as quedas, os ferimentos por arma de fogo, os ferimentos por arma branca, os esportes e as atividades recreacionais.3 O mergulho em águas rasas tem especial significado pela alta prevalência em nosso país.4
No Brasil, a prevalência do traumatismo raquimedular encontra-se em torno de 40 casos novos/ano/milhão de habitantes, cerca de 6 a 8 mil casos novos/ano.5 Em comparação, no Estado de São Paulo, dados da Secretaria de Estado da Saúde do Estado de São Paulo, mostram aproximadamente 1.750 casos novos/ano e uma população atual de aproximadamente 250.000 pacientes com lesão medular no Brasil.
Nas últimas duas décadas, várias pesquisas são realizadas na tentativa de obter-se um tratamento mais efetivo para a lesão medular espinal.6-8 Todas essas pesquisas envolvem basicamente quatro formas de abordagem do paciente com lesão medular aguda: a cirúrgica, a farmacológica, a biológica e a por meios físicos, sendo a oxigenoterapia hiperbárica e a hipotermia suas modalidades.
A oxigenoterapia hiperbárica é uma modalidade terapêutica fundamentada na obtenção de pressões parciais elevadas de oxigênio tecidual,9 ao respirar-se o oxigênio puro no interior de uma câmara hiperbárica, a uma pressão superior à da atmosfera.
A lesão medular apresenta mecanismos primários ou secundários de dano à medula espinal, a lesão mecânica primária e a lesão secundária resultante de um ou mais processos bioquímicos e celulares desencadeados pela lesão primária.10 O conceito de lesão secundária foi primeiro postulado por Allen,11 que propôs a existência de agentes nocivos presentes no material necrótico e hemorrágico que causam danos adicionais à medula espinal e esses agentes são fatores bioquímicos.
O objetivo desse estudo é verificar a eficácia da terapia por oxigênio hiperbárico, como tratamento isolado através de estudo experimental, controlado e randomizado, em ratos com uma contusão medular leve produzida por um equipamento computadorizado para impacto por queda de peso (NYU Impactor). Procura-se avaliar o efeito da terapia com oxigênio hiperbárico sobre a contusão medular, a avaliação funcional do déficit neurológico através da escala BBB,12 e as alterações encontradas no exame anatomopatológico.
Avaliaram-se 17 ratos Wistar machos, com peso variando de 265 a 426g, oriundos do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. No momento da recepção, todos os ratos foram avaliados quanto às condições gerais e à motricidade e identificados (marcação de listras pretas e vermelhas na cauda). Acondicionaram-se até cinco ratos de uma mesma ninhada por gaiola (40 x 60cm).
Optamos pelo uso de ratos da raça Wistar em função de sua disponibilidade em nosso meio e das menores dificuldades técnicas no manuseio desses animais. A espécie preferencial para experimentos com lesão medular deveria ser a dos primatas, mas sua utilização é limitada em função do custo elevado, pouca disponibilidade, dificuldades de manuseio e considerações éticas.13 O rato pode ser uma boa alternativa nestes experimentos posto que sua medula possui organização citoarquitetônica e vascularização similar ao humano.
Adotaram-se os seguintes critérios de inclusão e exclusão:
Ratos da raça Wistar;
Machos adultos jovens (20 a 25 semanas de vida inclusive);
Peso entre 250 e 450 gramas, inclusive;
Condição geral (pelagem e estado clínico) e motricidade normal;
Óbito após lesão;
Perda de tecido na área lesada;
Anomalias da medula na área lesada observada macroscopicamente;
Autofagia ou mutilação entre os animais;
Infecção profunda após lesão;
Infecção refratária a antibioticoterapia após lesão;
Infecção urinária após 10 dias de tratamento com antibiótico (presença de sangue na urina);
Ausência de controle de micção;
Movimentação normal na primeira avaliação após lesão (21 pontos na escala BBB (BASSO, BEATTIE e BRESNAHAN) de avaliação funcional).
Formação dos grupos experimentais
Os ratos foram separados aleatoriamente (por sorteio) e formaram dois grupos:
Grupo Controle - ratos submetidos à lesão medular leve através de um equipamento computadorizado para impacto medular por queda de peso - NYU Impactor ("New York University Spinal Cord Contusion Sistem - Impactor"), sem tratamento posterior;
Grupo Oxigênio Hiberbárico - ratos submetidos ao mesmo protocolo de lesão leve com o NYU Impactor e, após, submetidos ao protocolo de oxigenoterapia hiperbárica durante 30 dias (1 hora/dia).
Dos 20 ratos incluídos inicialmente, ocorreram três exclusões. Um rato do grupo Controle foi excluído por apresentar locomoção normal (21 pontos na escala BBB na primeira avaliação) após a lesão (critério de exclusão). Dois ratos do grupo Oxigênio Hiperbárico foram a óbito, um imediatamente após a lesão e o segundo entre o segundo e o nono dia após a lesão.
Previamente à lesão, anestesiaram-se os ratos com 55 a 75mg/kg de Pentobarbitalintraperitoneal.
A exposição da medula para contusão controlada foi realizada com o auxílio de um microscópio cirúrgico. Após tricotomia, realizou-se uma incisão na linha média dorsal para expor os arcos posteriores da coluna vertebral, de TVIII a TXII. Descolaram-se os músculos inseridos nos processos espinhosos e nas lâminas de TIX à TXI. Expuseram-se os processos articulares destas vértebras. A hemostasia, quando necessária, foi realizada com um coagulador bipolar. Removeram-se, com um micro sacabocados, o processo espinhoso e a lâmina da vértebra TX e a metade distal do processo espinhoso da TIX até expor a medula e permitir o posicionamento da ponta da haste (punção) do NYU Impactor.14
Adotou-se o modelo experimental de lesão medular do MASCIS ("Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study") padronizado para ratos Wistar.15,16
Decidiu-se pela produção de lesões leves através do equipamento computadorizado para impacto por queda de peso NYU Impactor. O teste de impacto consistiu na queda de uma haste de impacto de 10g de peso de uma altura pré-determinada de 12,5mm entre a ponta da haste (punção) e a superfície da medula espinal em queda livre, através de um tubo guia, monitorado por computador (velocidade da haste, deformação absoluta e relativa da medula, instante de contato efetivo e tempo de contato) de maneira a reduzir os fatores de imprecisão.
O equipamento computadorizado para impacto medular por queda de peso monitorada NYU Impactor (Figura 1) compõe-se de:
Dispositivo de impacto (haste de 10g a 12,5mm de altura pré-determinada para contusão leve, tubo guia e sistema de monitoração de posição, velocidade de queda, instante de contato, período de contato, deformação da coluna e deformação absoluta e relativa da medula);
Dispositivos de interfaceamento (instrumentação);
Microcomputador IBM-PC compatível;
Vídeo monitor VGA;
Placa de interface com saída paralela e temporizador.
Após a lesão, o rato foi colocado em uma superfície aquecida, não excedendo a temperatura de 38°C. Inspecionou-se o sítio da lesão da contusão. Na presença de hemorragia realizava-se a hemostasia. Em seguida, lavou-se o sítio da contusão com solução fisiológica de cloreto de sódio a temperatura ambiente. Realizou-se a aproximação dos planos teciduais musculares e fasciais e da pele com sutura de pontos simples com fio nylon monofilamentado 2.0.
Os ratos foram submetidos a antibioticoterapia para prevenir e/ou reduzir a infecção na ferida cirúrgica nas vias urinárias. Administrou-se, subcutaneamente, 25mg/kg de cefalotina (Keflin Neutro® - Ely Lilly) imediatamente após a lesão e uma vez ao dia durante os sete dias seguintes. Naqueles que apresentassem infecção estender-se-ia o tratamento até o 10º dia e caso não surtisse efeito o rato seria submetido à eutanásia (critério de exclusão).
Utilizou-se uma câmara hiperbárica tubular com 770mm de comprimento, 180mm de diâmetro interno e altura útil de 150mm (entre a plataforma e a parede superior) especialmente dimensionada para ratos, com paredes de acrílico transparente de 10mm de espessura. A câmara hiperbárica dispunha de uma válvula de controle na entrada, de um manômetro diferencial (kgf/cm2) (barômetro aneróide) para controle da pressão interna, de um fluxímetro na saída (l/min calibrado a 3,5kgf/cm2 ou 345kPa e 21°C) e de termômetro (°C). O fluxo de oxigênio (O2) provinha de um cilindro através de tubulação flexível (plástico). (Figura 2)
A recuperação da capacidade locomotora após lesão medular foi medida pela escala BBB (BASSO; BEATTIE; BRESNAHAN) de avaliação funcional.12
A escala BBB de avaliação funcional baseia-se em critérios observacionais específicos, definições simples e não ambíguas dos termos e permite uma rápida e precisa descrição da performance locomotora.
Esta escala foi adotada pelas instituições que integram o MASCIS e pelo LETRAN. Decidiu-se pela avaliação visual por time treinado (dois observadores), às cegas e pela menor avaliação.
Todos os ratos dos grupos Controle e Oxigênio Hiperbárico foram avaliados no 2º, 9º, 16º, 23º e 30º dia pós-operatório.
A avaliação consistiu em colocar o rato no centro de uma caixa de observação de 80x80cm e borda com 17cm de altura forrada com um campo cirúrgico azul turquesa (escuro) para maior contraste durante o período de observação (ratos brancos, fundo azul escuro). (Figura 3)
Avaliou-se a capacidade locomotora do rato. As observações sobre o movimento das articulações da pata posterior (quadril, joelho e tornozelo), a posição do tronco, do abdome, o deslocamento da pata (balanço) e o modo de contato da pata com o solo, a coordenação, os dedos, o contato e a liberação da pata com o solo, a instabilidade do tronco e a posição relativa da cauda, em relação ao lado direito e esquerdo, foram anotadas em formulário próprio.
O formulário permitiu o registro da identidade, do número de dias pós-operatório e dos comentários, e facilitou a descrição do movimento e a definição da pontuação. A escala BBB varia de 0 a 21 pontos para cada lado, esquerdo e direito.
A avaliação de cada rato foi realizada por dois observadores simultâneos, adequadamente treinados, neutros, sem conhecimento do grupo de origem do rato, de maneira a não interferir nos resultados.
Caso o rato, posicionado no centro da caixa, permanecesse imóvel por 15 a 20s, era estimulado a movimentar-se através de toques com um lápis.
A avaliação da capacidade locomotora do rato demorou de 4 a 5 minutos durante os quais anotaram-se, no respectivo formulário, as características do movimento executado.
Anotaram-se as características de consenso entre os observadores. Caso houvesse discordância, decidiu-se pela anotação da pior característica (menor pontuação).
Ao final do período de experimentação todos os ratos foram submetidos à eutanásia conforme legislação em vigor e seguindo os preceitos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA;17 utilizou-se dose letal de pentobarbital por via intraperitoneal.
Para a retirada da coluna vertebral, realizou-se uma nova incisão dorsal extensa, expôs-se a coluna e cortou-se com uma tesoura um segmento dede TVIII a TXII.
Com um micro sacabocados retiraram-se cuidadosamente todas as estruturas ósseas e de partes moles adjacentes à medula até expô-la completamente.
Realizou-se uma avaliação visual macroscópica da medula no local da contusão para verificar-se qualquer anomalia (critério de exclusão). Não se encontrou nenhuma.
A seguir a medula retirada foi encaminhada em frascos, devidamente identificados, com solução de formaldeído (10%) para o Serviço de Anatomia Patológica do Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
O estudo anatomopatológico consistiu de uma análise microscópica (óptica) de lâminas coradas pela hematoxilina-eosina (HE).
O Serviço de Patologia avaliou e graduou (ausente, discreto, moderado e acentuado) os casos quanto a:
Degeneração da Substância Nervosa;
Infiltrado Celular.
Os patologistas não foram informados quanto ao grupo de origem a que pertenciam as medulas dos ratos (avaliação cega).
No 2º dia pós-operatório, o grupo não tratado com oxigenoterapia hiperbárica (grupo controle) apresentou a média de 2,4 pontos na escala BBB, enquanto o grupo tratado apresentou média de 5,9 pontos na escala. (Figura 4)
No 9º dia pós-operatório, a diferença entre os grupos diminuiu na escala de avaliação motora, com o grupo controle apresentando 9,9 pontos, e o grupo tratado com oxigenoterapia hiperbárica tendo 11,9 pontos na escala BBB. (Figura 5)
No 16º dia pós-operatório, o grupo controle com oxigenoterapia apresentava 12,6 pontos, enquanto que o grupo submetido a câmara hiperbárica apresentava 14,4 pontos na escala BBB. (Figura 6)
No 23º dia, o grupo controle apresentava 13,8 pontos, contra 15,9 do grupo que recebeu oxigenoterapia hiperbárica. (Figura 7)
Por fim, no 30º dia pós operatório, a avaliação constatou que o grupo controle apresentou 15,6 pontos na escala BBB, enquanto que o grupo tratado apresentou 17,4 pontos. (Figura 8)
Em relação à hiperemia encontrada, no grupo controle evidenciou-se que 55,6% dos ratos apresentou hiperemia em grau moderado, e 44,4% em grau acentuado, não sendo notados indivíduos com graus discretos; já no grupo que recebeu oxigenoterapia hiperbárica, metade apresentou hiperemia em grau acentuado, ¼ em grau moderado, e ¼ em grau discreto. (Figura 9)
Quanto à degeneração de substância nervosa, no grupo controle ocorreu degeneração acentuada em 100% dos indivíduos, enquanto no grupo tratado, observou-se degeneração moderada em 37,5% e acentuada em 62,5% dos indivíduos. (Figura 10)
Na avaliação de necrose tecidual, o grupo controle apresentou resultados semelhantes a hiperemia encontrada, com necrose acentuada em 44,4%, e moderada em 55,6% dos indivíduos. Já no grupo tratado, 62,5% dos indivíduos apresentaram necrose acentuada, 25% moderada, e 12,5% sinais discretos. (Figura 11)
Por fim, na avaliação quanto ao infiltrado celular, os achados do grupo controle se deram com 33,3% de forma acentuada, 55,6% moderada e 11,1% ausente. No grupo que recebeu terapia em câmara hiperbárica, em 37,5% observou-se sinais acentuados, 25% sinais moderados, e 37,5% sinais discretos de infiltrado inflamatório. (Figura 12)
Para a avaliação da recuperação locomotora dos membros posteriores procedeu-se inicialmente mensurações em separado dos lados direito e esquerdo, dos grupos Controle e Oxigênio Hiperbárico, no 2º, 9º, 16º, 23º e 30º dia pós-operatório. O fato de não se ter comprovado diferenças funcionais estatisticamente significativas, permitiu o agrupamento dos resultados da função dos membros direito e esquerdo de cada grupo. Isto facilitou a interpretação absoluta dos resultados. (Figuras 4 a 12) Compararam-se, assim, as diferenças entre os resultados gerais dos grupos Controle e Oxigênio Hiperbárico.
Após a eutanásia, amostras dos tecidos medulares foram retirados do sítio da lesão e submetidos ao exame anatomopatológico, pelo método de coloração de hematoxilina e eosina, com a finalidade de comprovar estigmas da lesão tecidual. Este estudo se fez necessário para certificação de que o traumatismo fora efetivo na produção da contusão medular.
Os resultados da capacidade locomotora, obtidos pela escala BBB, do grupo Oxigênio Hiperbárico foi 59,3% superior ao do grupo Controle no 2º dia pós-operatório (Figura 4) e 20,2% superior no 9º dia. (Figura 5) No 16º dia a diferença não foi comprovada. (Figura 6) Novamente, no 23º dia o resultado da capacidade locomotora dos ratos do grupo Oxigênio Hiperbárico foi de 15,2% superior ao do grupo Controle (Figura 7). No 30º dia pós-operatório os resultados equivaleram-se. (Figura 8)
Através destes dados, constatou-se recuperação da capacidade locomotora de forma acentuada e acelerada nos ratos tratados com oxigenoterapia hiperbárica até o 9º dia pós-operatório. A partir daí, neste grupo, a progressão funcional decresceu gradualmente até o 16º dia. A diferença funcional foi novamente retomada em favor do grupo oxigênio hiperbárico no 23º dia e subsequente decréscimo para o nível de equivalência que ocorre no 30º dia, quando se deu a estabilização e equiparação dos resultados.
Constatou-se por estes resultados que do ponto de vista histológico não se provou o benefício da terapia com oxigênio hiperbárico, nos quesitos: hiperemia, degeneração da substância nervosa, necrose e infiltrado celular.
1. O exame anatomopatológico comprovou as alterações estruturais da medula espinal de maneira uniforme nos dois grupos.
2. A avaliação funcional do déficit neurológico mostrou-se semelhante após o método de contusão por impacto nos dois grupos.
3. A avaliação da recuperação da capacidade locomotora pela escala BBB, mostrou-se eficaz na interpretação do efeito da oxigenoterapia hiperbárica.
4. A lesão medular leve provocada nos ratos evoluiu de maneira diferente no grupo da oxigenoterapia hiperbárica comparativamente ao grupo controle, na fase inicial (efeito acelerador).
A contribuição dessa pesquisa experimental foi a demonstração do efeito acelerador na fase inicial da recuperação da capacidade locomotora dos ratos. A partir destes achados, a oxigenoterapia hiperbárica passa a ser ferramenta útil no arsenal terapêutico para a solução da intrincada patologia que é o traumatismo medular, entretanto, a complementação com recursos biológicos e celulares deverão constituir os próximos passos a serem trilhados. Ficam suspensas questões como tempo de aplicação, pressão ideal e os mecanismos de ação.
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