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Genotipagem de bactérias
Definição e retrospectiva histórica
A tipagem permite caracterizar a diversidade dos microrganismos existentes na Natureza, contribuindo para a sua classificação e para a discriminação entre indivíduos da mesma espécie.
A tipagem de microrganismos progrediu consideravelmente nos últimos anos, em resultado do desenvolvimento de técnicas moleculares que fazem uso da variação encontrada ao nível do seu genoma. O advento da tipagem molecular permitiu não só grandes avanços nos domínios da identificação, classificação e diagnóstico, mas também no estudo da evolução e filogenia dos microrganismos.
Antes do desenvolvimento das diversas técnicas de tipagem molecular, os procedimentos que permitiam fazer a destrinça de isolados bacterianos baseavam-se principalmente na comparação do fenótipo, ou seja, de características observáveis.
Os métodos fenotípicos de tipagem recorrem a testes morfológicos e bioquímicos, sensibilidade a fagos, sensibilidade a bacteriocinas, perfis imunológicos e perfis de susceptibilidade a agentes antimicrobianos. Apesar da sua grande utilidade na determinação do género e da espécie, a aplicabilidade destes métodos na tipagem ao nível da sub-espécie (conjunto de estirpes) é muito limitada. Devido ao facto de caracterizarem o fenótipo e não o genótipo, os resultados obtidos por estes métodos dependem fortemente das condições ambientais e são aplicáveis na tipagem de apenas algumas espécies.
Pelo contrário, macromoléculas como os ácidos nucleicos e as proteínas contêm informação e diversidade suficiente nas suas sequências para permitirem uma abordagem uniforme e simples com vista ao estudo da diversidade microbiológica. A análise de proteínas, embora tenha vindo a ser utilizada com algum sucesso em tipagem, apresenta também a limitação de apreciar a expressão de genes na dependência das condições ambientais, enquanto que a informação correspondente ao genótipo não é afectada por modificações ambientais e fisiológicas. Por isso, são utilizados predominantemente Métodos de tipagem baseados na análise de ácidos nucleicos.
Métodos e aplicações de genotipagem
Os métodos de tipagem molecular analisam uma parte ou a totalidade do genoma, pelo que são conhecidos por métodos de genotipagem. Baseiam-se no polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição gerados a partir do genoma de diversos organismos em comparação.
As abordagens mais importantes de tipagem molecular, baseadas na análise de ácidos nucleicos, podem dividir-se essencialmente em:
Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA genómico
Em qualquer uma das abordagens, o que se pretende obter é um padrão de fragmentos (bandas) de DNA, específico para cada estirpe, que permita fazer, de forma simples, a sua distinção.
Um sistema eficiente de tipagem molecular deverá ter um elevado poder discriminatório, ou seja, permitir a diferenciação clara de um elevado número de estirpes, e possuir elevada reprodutibilidade.
Nem todos os métodos são igualmente eficazes, diferindo, nomeadamente, no poder discriminatório e na destrinça que permitem dos vários níveis taxonómicos. Os vários métodos existentes variam ainda ao nível da simplicidade/dificuldade, rapidez, custos associados e necessidade de equipamento e mão-de-obra especializados. A adequação de um dado método de tipagem depende, portanto, do fim a que este se destina (identificação, classificação, diferenciação, etc).
A tipagem molecular é importante em estudos de biodiversidade, no acompanhamento de microrganismos geneticamente manipulados libertados no ambiente, na validação de microrganismos usados em processos biotecnológicos e no controlo microbiológico de produtos farmacêuticos.
A tipagem molecular encontra ainda aplicações em Microbiologia Clínica, nomeadamente em Epidemiologia, dado o seu potencial para esclarecer a origem e disseminação de uma estirpe causadora de um surto infeccioso. De facto, este resulta frequentemente da exposição a uma fonte comum do agente etiológico e da sua disseminação rápida entre a população potencialmente hospedeira. Organismos geneticamente relacionados partilham características genéticas, bioquímicas e, muitas vezes, factores de virulência. Assim, em Epidemiologia, o processo de tipagem é crítico, quer na identificação de surtos infecciosos e de episódios de transmissão cruzada de patogénicos nosocomiais, quer no reconhecimento da fonte de contaminação e de estirpes particularmente infecciosas.