Association of TGF-beta1, CD14, IL-4, IL-4R and ADAM33 gene polymorphisms with asthma severity in children and adolescents
http://dx.doi.org/10.1590/S0021-75572008000300004
Associação dos polimorfismos dos genes TGF-b1, CD14, IL-4, IL-4R e ADAM33 com a gravidade da asma em crianças e adolescentes
Isabel C. J. de FariaI; Elisangela J. de FariaI; Adyléia A. D. C. ToroII; José Dirceu RibeiroIII; Carmen Silvia BertuzzoIV
IDoutora. Bióloga, Departamento de Genética, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP
IIMestre. Médica assistente, Departamento de Pediatria, Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP, Campinas, SP. Centro de Investigação em Pediatria, UNICAMP, Campinas, SP
IIIProfessor livre docente, Departamento de Pediatria, Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP, Campinas, SP. Pesquisador, Centro de Investigação em Pediatria, UNICAMP, Campinas, SP
IVDoutora. Bióloga. Professora livre docente, Departamento de Genética, Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP, Campinas, SP
OBJETIVO: Verificar, em uma amostra de pacientes com asma atópica persistente leve, moderada e grave, a associação entre os polimorfismos dos genes fator de crescimento transformante-b1 (TGF-b1) (C-509T e T869C), CD14 (C-159T), IL-4 (C-590T), IL-4R (ILe50Val) e ADAM33 (S_2) com a gravidade da asma.
MÉTODOS: Realizou-se um estudo clínico laboratorial prospectivo em pacientes com asma atópica persistente, comparados a um grupo controle no Hospital Universitário da Universidade Estadual de Campinas nos anos de 2006 e 2007. A análise do polimorfismo T869C do gene TGF-b1 foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) + sistema de amplificação refratária de mutação (ARMS). Os outros polimorfismos, C-509T do gene TGF-b1, C-159T do gene CD14, C-590T da IL-4, ILe50Val da IL-4Ra e S2 do gene ADAM33, foram detectados por PCR e enzima de restrição.
RESULTADOS: Foram incluídos 88 pacientes com asma atópica persistente (27 leves, 23 moderados e 38 graves) e 202 indivíduos saudáveis, doadores de sangue. Em relação ao polimorfismo T869C (TGF-b1), observou-se uma associação entre o genótipo CC e os pacientes com asma grave. Nenhuma associação foi encontrada com os polimorfismos C-509T (TGF-b1), C-590T (IL4) e S_2 (ADAM33). Quando se comparou a distribuição da freqüência genotípica do polimorfismo C-159T (CD14) na asma grave com o grupo controle, foi observado um resultado significativo com o genótipo TT. Houve associação significativa do genótipo Val/Val (IL-4R) com a asma leve.
CONCLUSÃO: Nossos resultados indicam que os polimorfismos T869C (TGF-b1), C-159T (CD14) e Val/Val (IL-4R) podem estar envolvidos na modulação da gravidade da asma.
Palavras-chave: Genes da asma, polimorfismos, SNP, ADAM33, CD14, TGF-b1.
A asma é a doença crônica mais comum na infância e adolescência. É causada por fatores genéticos e ambientais, e vários genes têm sido implicados na sua patogenia1.
Alguns estudos, incluindo com gêmeos2, têm mostrado que uma série de genes e seus polimorfismos influenciam os desenvolvimentos imune e pulmonar e a resposta a fatores ambientais, contribuindo para o aparecimento e/ou gravidade da asma. O gene fator de crescimento transformante-b1 (TGF-b1) está localizado no cromossomo 19q133,4.
Estudos sobre a associação dos polimorfismos C-509T e T869C do gene TGF-b1 com o risco de asma têm sido controversos, sendo que alguns encontraram associação positiva5-8 e outros negativa9,10, com níveis elevados de TGF-b1, imunoglobulina E (IgE) no plasma e maior risco de asma.
A proteína TGF-b1 é uma citocina multifuncional que está aumentada no fluido do lavado brônquico de asmáticos quando comparada à de indivíduos não asmáticos11,12. Ela é importante no crescimento, transformação, reparo de tecido, fibrose e modulação de respostas imune inflamatórias13. Sua função na asma ainda não é completamente conhecida.
O gene CD14 está localizado no cromossomo 5q. O polimorfismo (C-159T) tem sido associado com alterações nos níveis de CD14 e IgE em várias populações de diferentes etnias14,15.
CD14 é um receptor multifuncional, sendo expresso na superfície de monócitos, macrófagos e neutrófilos ou solúvel no soro16. É o principal receptor de lipopolissacarídeos (LPS) ou endotoxinas inaladas, que são potentes indutoras da inflamação pulmonar, podendo ativar o sistema imune e promover a diferenciação de Th1 e/ou supressão de Th217.
Tem sido proposto que expressões alteradas de CD14, mais aumentadas nos asmáticos depois da inalação com LPS18, possam alterar o balanço de células Th1-Th2, influenciando os níveis de IgE e a inflamação nas doenças alérgicas como a asma14.
Assim, as alterações na expressão de CD14 parecem ser importantes, particularmente na asma alérgica, e esta expressão é regulada, ao menos parcialmente, pelo gene.
O gene interleucina 4 (IL-4), localizado na região do cromossomo 5q31, também tem sido associado com atopia. A IL-4 é a principal citocina responsável pela mudança de expressão do linfócito B de imunoglobulina M (IgM) para IgE19.
A substituição do nucleotídeo (C-T) na posição -590 da região promotora do gene da IL4 está presente em aproximadamente 27% dos caucasóides. O alelo IL4-590T foi associado com a expressão aumentada do gene in vitro e com maiores níveis de IgE in vivo20. O alelo IL4-590T foi associado com asma, rinite e atopia em um estudo com crianças com risco para doenças alérgicas19. Esse alelo também tem sido associado com baixos valores de volume expiratório forçado do primeiro segundo (VEF1) em uma população caucasóide com asma21. Esses dados sugerem que o polimorfismo C-590T poderia influenciar a gravidade da asma.
O gene receptor da interleucina 4 (IL-4R) está localizado no cromossomo 16 p12.1-p11.2, uma região ligada a aumento de respostas de IgE. Tem papel crucial na inflamação alérgica através de sua função na sinalização de IL-4 e IL-1322.
Vários polimorfismos de base única (SNP), identificados na região codificante deste gene, foram associados com asma e atopia23,24. O polimorfismo Ile50Val tem sido extensamente estudado e associado com níveis de IgE e asma atópica23; no entanto, nem todas as associações foram replicadas em outras populações25,26.
O gene desintegrina e metaloprotease 33 (ADAM33) está localizado no cromossomo 20p13, sendo inicialmente identificados 37 SNP27. Desde o primeiro relato de associação entre os polimorfismos de ADAM33 e asma em duas populações caucasóides do Reino Unido e dos EUA, um grande número de estudos tem sido publicado com diversos resultados. Várias associações entre diferentes fenótipos de asma, bem como hiperresponsividade brônquica (HRB) e diferentes SNP no gene, têm sido demonstradas28-30.
O ADAM33 foi o primeiro gene identificado por clonagem posicional a ser publicado como um possível candidato para o desenvolvimento de asma e HRB27. A proteína ADAM33 é expressa em células do músculo liso dos brônquios e fibroblastos pulmonares, exercendo importante função no remodelamento das vias aéreas31.
A asma tem sido descrita como um grupo heterogêneo de síndromes, mas poucos avanços têm sido encontrados para distinguir os numerosos fenótipos clínicos do ponto de vista genético-molecular.
O objetivo deste estudo foi verificar a associação entre os polimorfismos dos genes TGF-b1 (C-509T e T869C), CD14 (C-159T), IL-4 (C-590T), IL-4R (ILe50Val) e ADAM33 (S_2) com a gravidade da asma.
Realizou-se um estudo clínico laboratorial e prospectivo nos departamentos de genética médica e de pediatria (setor de pneumologia pediátrica) da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) nos anos de 2006-2007.
O estudo foi avaliado e aprovado pelo comitê de ética da instituição (parecer 172/2006), e todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes de iniciarem o estudo.
Foram incluídas crianças e adolescentes, de ambos os gêneros, com asma atópica persistente (AAP) (leve, moderada e grave).
Os pacientes foram diagnosticados conforme o grau de gravidade da asma segundo os critérios da Global Initiative for Asthma32 (GINA), e todos apresentavam evidência espirométrica de resposta ao uso de medicamentos beta-agonistas, reatividade positiva nos testes cutâneos de hipersensibilidade imediata para antígenos inalatórios e aumento dos níveis séricos de IgE.
O DNA foi extraído de células de sangue periférico, de acordo com o método clássico de fenol/clorofórmio33.
Os métodos, as seqüências de primers e as enzimas de restrição utilizadas, bem como o tamanho dos fragmentos gerados pelos polimorfismos34-37 dos genes TGF-b1, CD14, IL-4, IL-4R, ADAM33, estão descritos na Tabela 1.
As análises da associação das variações entre os pacientes asmáticos e o grupo controle foram feitas através do teste qui-quadrado de Pearson, sendo que, em determinadas análises, devido ao valor das caselas, foram agregados genótipos e utilizado o teste exato de Fisher. Foi realizado o cálculo de odds ratio (OR) pelo teste exato de Fisher. A diferença entre os grupos foi estatisticamente significativa quando o valor do teste aplicado foi p < 0,05. O programa estatístico utilizado foi o Epi-Info 2000, versão 1.1.2.
Foram avaliadas 88 crianças e adolescentes asmáticos, 53% femininos, 7-18 anos de idade, média de idade de 10,3±2,79 anos e grupo étnico composto de 92% caucasóides, 7% pardos e 1% negróides. O grupo controle foi constituído de 202 sujeitos (média de idade de 34±11,3 anos), doadores de sangue, sendo 79,2% caucasóides, 20,3% negróides e 0,5% de etnia oriental.
Dentre os pacientes com AAP, havia 27 leves, 23 moderados e 38 graves (Tabela 2).
Com relação ao polimorfismo T869C (TGF-b1), a amostra de pacientes asmáticos encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) (χ2(2) = 2,83; p = 0,24), o que não acontece com a amostra controle (χ2(2) = 10,58; p = 0,005). Não foi encontrada diferença na distribuição genotípica entre asmáticos e grupo controle (χ2(2) = 0,67; p = 0,71), o mesmo ocorrendo entre os grupos de gravidade variável. No entanto, na comparação de cada grupo de gravidade com o grupo controle, observou-se uma diferença significativa em relação à asma grave e o grupo controle (χ2(2) = 9,70; p = 0,007). Essa diferença ocorria devido a um acúmulo de indivíduos com genótipo CC entre asmáticos graves em relação ao grupo controle. Portanto, o genótipo CC poderia ser um fator de gravidade para a asma (χ2 = 7,80; p = 0,005; OR = 2,99, 1,25-7,09).
Para o polimorfismo C-509T do gene TGF-b1, a amostra de pacientes asmáticos estava em EHW (χ2(2) = 0; p = 1), bem como a amostra controle (χ2(2) = 1,79; p = 0,41). Os genótipos CT e TT foram agrupados quando mostravam valor < 5 para a análise estatística. Não houve diferenças significativas com relação à presença e gravidade da asma.
Com relação ao polimorfismo C-159T (CD14), a amostra de pacientes estava em EHW (χ2(2) = 0,21; p = 0,90), o mesmo não acontecendo com a amostra controle (χ2(2) = 18,72; p = 0,00008). A distribuição genotípica por grupo de gravidade não mostrou diferença estatística.
Quando se comparou a distribuição genotípica da asma grave com o grupo controle, foi observado resultado significativo com acúmulo do genótipo TT em relação à asma grave (χ2(2) = 44,02; p = 0,000000). Constatou-se que o genótipo TT representou um fator de risco para a asma grave (χ2 = 31,94; p = 0,000; OR = 11,19, 3,74-34,24).
Com relação ao polimorfismo Ile50Val (IL-4R), a amostra de pacientes (χ2(2) = 1,47; p = 0,47) e de controles (χ2(2) = 0,11; p = 0,94) estava em EHW. Quando foi realizada a distribuição genotípica por gravidade da asma, na comparação entre a asma leve e grave, foi observada diferença estatística significante com o aumento de portadores do genótipo Val/Val entre asmáticos do grupo leve. Verificou-se que o genótipo Val/Val representou um fator de proteção para a gravidade da asma (χ2(2) = 8,85; p = 0,004; OR = 9,0, 1,54-90,89).
Considerando o polimorfismo C-590T (IL-4), a amostra de pacientes (χ2(2) = 0,06; p = 0,96) e controles (χ2(2) =1,27; p = 0,53) estava em EHW, e não houve diferenças significativas com relação à presença e gravidade da asma.
Para o polimorfismo S-2 (ADAM33), a amostra de pacientes estava em EHW (χ2(2) = 0,11; p = 0,94), ao passo que a amostra controle não estava (χ2(2) = 19,50; p = 0,000058). Quando foi comparada a distribuição genotípica entre os grupos de gravidade, nenhuma alteração foi encontrada.
Este é o primeiro estudo no Brasil a verificar a associação entre os polimorfismos dos genes TGF-b1 (C-509T e T869C), CD14 (C-159T), IL-4 (C-590T), IL-4R (ILe50Val) e ADAM33 (S_2) com a gravidade da asma.
A asma pode ser denominada uma doença genética complexa em que há múltiplos efeitos genéticos interagindo com o ambiente para modificar a susceptibilidade e a gravidade da doença38.
Em alguns polimorfismos, a amostra controle não se encontrava em EHW. Acredita-se que isso se deva ao fato de que, na Lei, preconiza-se uma população ideal, e nossa amostra controle foi constituída por doadores de sangue, entre os quais são selecionados indivíduos saudáveis. Nos casos dos polimorfismos estudados, por interferirem em mecanismos relacionados com a inflamação, ao utilizar doadores de sangue, estaremos excluindo indivíduos que tenham genótipos desfavoráveis. Com isso, acabamos por utilizar uma população mais homogênea e antagônica em termos fenotípicos em relação à de asmáticos e, portanto, pequenas alterações poderiam ser melhor evidenciadas. De qualquer maneira, houve uma maior valorização dos resultados encontrados entre os grupos de gravidade.
Pulleyn et al.5 encontraram uma associação entre o polimorfismo C-509T do gene TGF-b1 e a gravidade da asma, sendo que houve diferença significativa na freqüência de genótipos de C-509T quando o grupo leve, grave e os controles eram comparados. Houve um alto nível de homozigotos para o alelo -509T no grupo grave. Quase duas vezes mais (1,8 vezes) asmáticos graves tinham o genótipo TT, quando comparados a asmáticos do grupo leve, e esta diferença aumentava para 5,6 vezes quando comparados aos controles. Uma diferença significativa também existiu quando somente os grupos leve e grave foram comparados. Esses resultados sugerem que este alelo está mais associado com a gravidade preferencialmente do que com o início da asma ou atopia, em contraste com estudos nos quais os polimorfismos têm sido comparados entre asmáticos e controles, como na IL-1339.
Há evidências de que os polimorfismos C-509T e T869C de TGF-b1 estejam associados à atividade transcricional do gene. O polimorfismo C-509T, em homozigose, foi associado com níveis baixos da concentração de TGF-b1 circulante, quando comparado com outros genótipos, em mulheres brancas e na população indiana3. Por outro lado, o genótipo CC do polimorfismo T869C foi relacionado com uma alta concentração de TGF-b1 em japoneses40, mas não em indivíduos brancos41. Em outro estudo, Li et al.8 verificaram que os polimorfismos C-509T e T869C aumentavam o risco de asma e atopia em crianças no México.
Tem sido sugerido que o aumento da expressão de TGF-b1 deve ser prejudicial para as vias aéreas de indivíduos com asma, estimulando o remodelamento das mesmas. Sobre este paradigma, variantes genéticas que estão associadas com níveis elevados de TGF-b1, como o alelo T de C-509T e o alelo C de T869C, deveriam estar associadas à alta prevalência ou ao aumento da gravidade da asma7.
O polimorfismo T869C do gene TGF-b1, em nossa amostra, mostrou uma associação entre o genótipo CC e os pacientes portadores de asma grave. Não houve diferença significativa entre o grupo total de asmáticos e o grupo controle saudável com relação ao genótipo CC. No entanto, Mak et al.7, estudando 250 chineses portadores de asma, demonstraram que os indivíduos com genótipo CC teriam maior susceptibilidade à asma. Com relação ao polimorfismo C-509T, em nosso estudo, nenhuma associação foi encontrada.
O polimorfismo C-159T do gene CD14 tem sido associado ao aumento da expressão de CD14 in vitro e no soro de crianças14, com níveis séricos alterados de IgE e testes alérgicos positivos em diferentes populações14,15. Kedda et al.35 confirmaram associações entre C-159T e atopia, mas não encontraram associação entre este polimorfismo e asma ou gravidade da asma em uma população australiana.
É possível que o polimorfismo C-159T tenha uma influência relacionada à idade no desenvolvimento de atopia. Este polimorfismo tem sido associado à expressão aumentada de CD14 no soro de crianças13, e não há diferenças nos níveis de CD14 no soro de doadores de sangue adultos com diferentes genótipos para CD1435. Adicionalmente, em um estudo longitudinal em indivíduos brancos da Austrália com idade entre 8-25 anos, foi encontrado que os portadores do genótipo CC eram provavelmente os que tinham atopia mais cedo, sugerindo que a influência do polimorfismo -159C na atopia pode ser específico da idade42. Existem evidências que atopia e asma são entidades próximas e estão relacionadas à associação positiva entre o nível sérico de IgE, testes alérgicos positivos, hiperresponsividade e desenvolvimento de asma43. Espera-se, então, que alelos associados com atopia tenham prevalência mais alta entre asmáticos do que na população geral15. Não há publicações mostrando associação entre o polimorfismo C-159T e a gravidade da asma, embora tenha sido sugerido que este polimorfismo modifique a gravidade da obstrução do fluxo aéreo em asmáticos35.
No presente estudo, quando se comparou a distribuição genotípica do polimorfismo C-159T na asma grave com o grupo controle, foi observado um resultado significativo com genótipo TT em relação à asma grave. Constatamos que o genótipo TT representou um fator de risco para a asma grave.
No polimorfismo C-590T do gene da IL-4, sua variante está relacionada com o aumento da transcrição do gene. A incidência deste polimorfismo em um estudo com estadunidenses foi de 40%, e o alelo T esteve associado ao aumento da produção de IgE, testes alérgicos positivos e asma20. Essa associação não foi encontrada em australianos, britânicos44 e italianos45. Estudos em japoneses confirmaram a associação deste polimorfismo com asma25 e dermatite atópica20. Esse polimorfismo também foi relacionado com atopia20 e decréscimo da função pulmonar4. Kamali-Sarvestani et al.46, ao analisarem o polimorfismo C-590T em asmáticos do Irã, verificaram que esse polimorfismo estava associado com a asma e poderia modular sua gravidade.
A IL-4 exerce suas funções através da ligação com seu receptor, a IL-4R. No polimorfismo Ile50Val do gene da IL-4Ra, a variante Ile50 foi associada com asma atópica e não teve associação com a não atópica em japoneses. Inversamente, Noguchi et al.25 verificaram que o polimorfismo Ile50Val não exerce função na predisposição genética da etiologia da atopia ou asma em outra população japonesa. Outros estudos não encontraram associação entre este polimorfismo e asma em outros grupos étnicos26,47,48. Zhang et al.49, ao investigarem uma associação entre o polimorfismo Ile50Val com a asma e níveis altos de IgE, em três populações asiáticas provenientes da China, Malásia e Índia, verificaram que, na China, a prevalência do genótipo Ile50/Ile50 era significantemente menor que na Malásia, sendo que este genótipo está relacionado com o aumento de IgE somente na Malásia. Esse estudo mostrou que a associação entre este polimorfismo e a asma difere nesses grupos étnicos. Howard et al.50 analisaram os polimorfismos do gene IL-4R em famílias da Alemanha e não observaram evidências de que o polimorfismo ILe50VaL seja o principal responsável pela susceptibilidade da alergia, sugerindo que outros polimorfismos da IL-4R estariam associados com asma e atopia.
Com relação ao polimorfismo C-590T do gene IL-4, em nosso estudo, nenhuma associação foi encontrada. Com relação ao polimorfismo Ile50Val do gene IL-4R, verificou-se que o genótipo Val/Val representou um fator de proteção para a gravidade da asma.
Hirota et al.51 encontraram uma significante associação com a susceptibilidade de asma em uma população japonesa para três SNP (S_2, T_1, T_2). Esses resultados são consistentes com outro estudo em uma população caucasóide dos EUA52.
Jongepier et al.28 investigaram fatores genéticos e ambientais que possam ter contribuído para esse declínio acelerado em 200 pacientes com asma crônica, os quais foram estudados anualmente por 25 anos. Esses autores mostraram que a variante do polimorfismo do alelo S_2 estava significantemente associada com o declínio dos valores VEF1 e concluíram que esta variante de ADAM33 não era somente importante no desenvolvimento da asma, mas também na progressão da doença e aumento do remodelamento das vias aéreas.
Simpson et al.53 verificaram recentemente que polimorfismos em ADAM33 poderiam influenciar a função pulmonar na infância e concluíram que a mesma, no início da vida, é geneticamente determinada, podendo aumentar o risco de asma. Neste estudo, nenhuma associação foi encontrada em relação ao ADAM33 e a alergia.
No presente estudo, quando foi comparada a distribuição genotípica do polimorfismo S_2 entre os grupos de gravidade, nenhuma alteração foi encontrada.
É possível que resultados diferentes possam ser encontrados em outras populações ou grupos raciais. Como diferenças étnicas e raciais são comuns em sistemas polimórficos, alelos variantes ou grupos de genes interagindo induzem a expressão do fenótipo clínico em diferentes populações.
Portanto, em nosso estudo, os polimorfismos T869C do gene TGF-b1, C-159T do gene CD14 e Ile50Val do gene IL-4R podem ser moduladores da gravidade da asma. Embora nosso estudo tenha incluído vários genes e seus polimorfismos e tenha mostrado que genótipos distintos podem ter expressões clínicas diferentes, outros estudos com populações maiores poderão esclarecer o real papel dos polimorfismos genéticos nos vários graus de gravidade da asma.
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