Efeito da concentração e temperatura de adição de trealose em diluentes para a congelação de sêmen ovino em palhetas
http://dx.doi.org/10.1590/S0103-84781995000100020
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO E TEMPERATURA DE ADIÇÃO DE TREALOSE EM DILUENTES PARA A CONGELAÇÃO DE SÊMEN OVINO EM PALHETAS1
EFFECT OF THE CONCENTRATION AND ADDITION TEMPERATURE OF TREHALOSE IN EXTENDERS ON FREEZING RAM SEMEN IN STRAWS
Adilson Moura2 João Carlos Deschamps3 José Carlos Ferrugem Moraes4
Palavras-chave: congelação de sêmen, diluentes, trealose, ovinos
Key words: frozen semen, semen extenders, trehalose, sheep
Nos últimos 50 anos houve a geração de um apreciável volume de conhecimento científico e desenvolvimento tecnológico sobre a congelação de sêmen ovino. Considerando aspectos relativos a embalagem, concentração, metodologia de uso e/ou via de inseminação e composição dos diluentes (EVANS & MAXWELL, 1987). A despeito do conhecimento acumulado há necessidade de maiores estudos nos aspectos mencionados anteriormente em função de taxas de prenhez obtidas pela inseminação com sêmen congelado via cervical não satisfatórias nem repetitivas e de que as taxas de prenhez pela inseminação intrauterina apresentam alta variabilidade (EVANS, 1991).
No que concerne a possibilidade de aprimorar os diluentes, a função e o metabolismo dos crioprotetores nos diluidores para congelação de sêmen ovino, ainda não estão adequadamente investigados (SANCHEZ-PARTIDA et al., 1992). A trealose é um dissacarídio encontrado nas espécies animais e vegetais capazes de manterem íntegras suas membranas em condições extremas de temperatura, envolvendo a perda de água (CROWE et al., 1987). Estes mesmos pesquisadores apresentaram evidências que a trealose pode contribuir na estabilização das membranas durante o processo de congelamento (CROWE et al., 1990).
A trealose foi utilizada como crioprotetor adicional no processo de congelação de embriões de camundongos (HONADEL & KILLIAN, 1988), refrigeração e congelação de sêmen suíno (REVELL & GLOSSOP, 1989; BORDIGNON, 1993) e de sêmen ovino em pelotes (OLIVEIRA & MORAES, 1991/ 1993).
O objetivo deste estudo é de investigar os efeitos da adição da trealose em diluidores desenvolvidos para a congelação de sêmen ovino em palhetas sobre a motilidade espermática e integridade acrossomática, após os procedimentos de congelação e descongelação.
As amostras de sêmen foram obtidas com vagina artificial de três carneiros das raças Texel (2) e Corriedale (1). O sêmen até os procedimentos de diluição foi incubado a 30°C. Foram utilizadas amostras com motilidade progressiva superior a 70% na formação de "pools" para congelação, sempre contendo três ejaculados de pelo menos dois carneiros. A concentração espermática de cada "pool" foi estimada em câmara hematimétrica, sendo ajustada a uma concentração final de 100 milhões de espermatozóides por ml em todos os tratamentos.
Os diferentes "pools" sequencialmente foram diluídos e processados seguindo os protocolos descritos por COLAS (1975) e FISER et al. (1982), respectivamente, diluidores INRA e TRIS/FRUTOSE, sendo acondicionados em palhetas de 0,5ml.
A descongelação das palhetas foi em banho-maria a 37°C por 20 segundos. As avaliações procedidas foram: a motilidade espermática (MOT) em microscopia de contraste de fase logo após a descongelação, duas e cinco horas após; a integridade acrossomática (INTA) logo após a descongelação e após cinco horas de incubação a 37°C em microscopia de contraste de fase em amostras fixadas em formol salino tamponado (HANCOCK, 1957). Foram avaliadas três palhetas em cada tratamento e os valores de MOT e INTA em cada tempo de incubação após a descongelação submetidos a análise de variância (SNEDECOR & COCHRAN, 1967).
No delineamento experimental foram ajustados dois modelos estatísticos. No modelo 1 foram considerados além do tempo de incubação os efeitos principais da adição da trealose (g/100ml) em diferentes concentrações (0; 2; 4; 6%), a formulação original do diluente (INRA; TRIS/FRUTOSE), a repetição/bloco (1; 2; 3) em função do dia da congelação e as interações de primeira ordem significativas (P < 0,05) sobre a motilidade espermática e a integridade dos acrossomas. No modelo 2 foram incluídos os efeitos do tempo de incubação (0; 2; 5h), da quantidade de trealose (2; 4; 6%), da temperatura de sua adição ao diluente (4°C; 30°C), da fórmula do diluente (INRA; TRIS/FRUTOSE), da repetição/bloco (1; 2; 3) e das interações de primeira ordem significativas sobre ambas as variáveis medidas.
Na Tabela 1 são apresentados os quadrados médios e níveis de significância para os efeitos principais e interações, considerando o modelo 1. O alvo desta análise foi de verificar como se comportavam os dois diluidores testados com a adição de trealose. De um modo geral a adição de trealose não resultou em benefício para a motilidade espermática. Embora tenha sido verificada diferença (P<0,05), houve redução progressiva na motilidade a medida que aumentava a concentração de trealose. No que diz respeito a integridade acrossomática também não houve benefício com a adição de trealose nos dois diluentes. Os efeitos óbvios como o tempo de incubação e bloco foram significativos tanto para MOT quanto para INTA. Pode ser constatada diferença (P < 0,01) para MOT entre os diluidores, facilmente explicável pelos seus constituintes, com uma superioridade em tomo de 25% para o TRIS/FRUTOSE, que apresenta composição mais completa, incluindo tampões e diversos açucares (FISER et al., 1982).
As respostas diferenciais na motilidade espermática entre diluidores podem ser visualizadas mais adequadamente através das interações "diluente x adição/concentração" e "diluente x tempo de incubação" (Figuras 1 e 2). Estes resultados indicam que efetivamente a composição dos diluentes é um tema muito complexo, requerendo inúmeros experimentos fatoriais para sua formulação e não a simples adição de uma nova substâncias com propriedades crioprotetoras.
A despeito dos resultados negativos da adição da trealose nos diluentes testados, o objetivo do modelo 2 foi de verificar se a temperatura em que a trealose foi adicionada nas formulações com 2%, 4% e 6% afetaria a MOT e a INTA. Os resultados da análise da variância (Tabela 2) indicam que a temperatura de adição afeta significativamente a MOT, com uma superioridade em torno de 8% quando o dissacarídio foi adicionado na temperatura de 30°C. O efeito diferencial sobre a MOT em função do diluente é também importante apenas no diluidor INRA, também culminando com maior % de células móveis quando adicionada a 30°C. Um aspecto interessante é que tanto a MOT quanto a INTA são afetadas diferentemente pela temperatura de adição e concentração da trealose adicionada (Figura 3).
Os padrões de variação observados sugerem que a trealose em concentrações crescentes a partir de 2g/100ml pode ser detrimental tanto à motilidade espermática quanto a integridade acrossomática, porem depende do diluente a que foi adicionada. De um modo geral estes resultados são similares aos obtidos pela adição de trealose ate 0,3% ao diluidor BTS desenvolvido para o congelamento de sêmen suíno em macrotubos (BORDIGNON, 1993), porem contrastam com os de OLIVEIRA & MORAES (1991; 1993), que evidenciaram incremento na MOT com uma concentração de 0,2% de trealose adicionada ao sêmen ovino congelado em pelotes com o diluidor desenvolvido por SALAMON (1970).
Os presentes resultados não recomendam a inclusão da trealose visando incrementar a qualidade in vitro do sêmen ovino congelado em palhetas nas concentrações e diluentes testados, no entanto, sugerem maiores estudos quanto a um possível efeito tóxico da trealose e possíveis interações com outros constituintes dos diluentes já formulados para o congelamento de sêmen ovino.
BORDIGNON, V. Efeito da trealose sobre a motilidade, acrossoma e fertilidade do sêmen congelado de suínos. Pelotas, 1993. 57 p.. Tese (Mestrado em Sanidade) - Curso de Pós-graduação em Sanidade, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas 1993. [ Links ]
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1Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor, apresentada ao Curso de Pós-graduação em Sanidade Animal. Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
2Médico Veterinário, MSc, Merck Sharp & Dohme, Rua Cristóvão Colombo, 3870. apto. 304, 90560-005, Porto Alegre, RS.
3Médico Veterinário. PhD, Professor Adjunto, Centro de Biotecnologia. Faculdade de Veterinária. UFPel. 96100-900. Pelotas. RS. Autor para correspondência.
4Médico Veterinário, Doutor, Pesquisador, Centro de Pesquisa de Pecuária dos Campos Sulbrasileiros. Embrapa, Caixa Postal 242, 96400-970, Bagé, RS.