Artigo Original • Rev. Bras. Reumatol. 49 (4) • Ago 2009 • https://doi.org/10.1590/S0482-50042009000400006 copiar
Para determinação do número total de células NK, 50 μL de sangue (contendo, no máximo, 0,5 x 106 células/mL por tubo) foram corados com 3 μL de anti-CD56-PE (BD 347747 Califórnia, EUA) e incubados por vinte minutos a 4 ºC. Em seguida, as hemácias foram lisadas com Quicklise (Cytognos, Salamanca, Espanha) por 15 minutos e as células restantes foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada pH 7,2 gelado. Logo após, as células foram centrifugadas por três minutos a 400 x g. Para a quantificação do percentual de apoptose nas células NK (CD56+), utilizou-se o kit de detecção de apoptose da BD Pharmingen™ (Califórnia, EUA), que cora com anexina V e iodeto de propidium. Neste ensaio, a apoptose é quantificada por meio da detecção de fosfatidilserina exposta na superfície de células apoptóticas usando anexina V, que tem afinidade por ela,16e o PI detecta células vivas ou mortas. As células, então, foram ressuspendidas em 300 μL de solução salina tamponada; 2,5 μL de anexina-V-FITC e 2,5 μL de PI (FL-3) foram adicionados, seguidos de homogeinização e incubação por 15 minutos em câmara escura. Após a incubação, foram adicionados 300 μL de solução salina tamponada às células, as quais foram processadas e adquiridas no citômetro FACSCalibur (BD Biosciences, Califórnia, EUA) no máximo em uma hora. Foram adquiridos 10 mil eventos nos canais FL-1, FL-2 e FL-3. A análise foi realizada com lógica multiparamétrica para visualizar o movimento de migração das células vivas para aquelas em apoptose (inicial e tardia) e mortas. Utilizou-se o programa Paint'A'Gate para essa análise e a quantificação dessas populações.