Auxílio à pesquisa 16/14171-0 - Transdução de sinais, Osteoblastos - BV FAPESP
Papel das Vias de Sinalização de Wnt no Potencial Osteogênico de Superfície de Titânio com Nanotopografia
Processo: 16/14171-0
Pesq. associados: Adalberto Luiz Rosa ; Paulo Tambasco de Oliveira
Assunto(s): Transdução de sinais Osteoblastos Osso e ossos Proteínas Wnt Titânio Implantodontia
A superfície de titânio (Ti) com nanotopografia, obtida por condicionamento com solução de H2SO4/H2O2, tem grande potencial osteogênico por modular vias de sinalização envolvidas na diferenciação osteoblástica, como por exemplo as vias de integrinas e proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs). Considerando a participação importante de vias de Wingless-Type mouse mammary tumor vírus [MMTV] Integration Site (Wnt) no processo de osteogênese, nós elaboramos a hipótese de que essas vias estão, ao menos em parte, envolvidas no potencial osteogênico da superfície de Ti com nanotopografia. Para testar essa hipótese, células osteoblásticas da linhagem MC3T3-E1 serão cultivadas sobre discos de Ti com nanotopografia e usinados (controle) e será avaliada a expressão gênica, por PCR em tempo real, de marcadores das vias de Wnt canônica e não-canônica Wnt/Ca2+. A partir dos resultados de expressão gênica, serão selecionados um gene-alvo da via de sinalização de Wnt canônica e um da via não-canônica regulados de forma mais intensa pela superfície de Ti com nanotopografia para a aquisição de agrupados de curtas repetições palindrômicas regularmente interespaçadas (CRISPR-Cas9/gRNA) que serão utilizados para o silenciamento dos dois genes-alvos de interesse. A eficácia do silenciamento dos CRISPR-Cas9/gRNA será avaliada por PCR em tempo real e Western blot para determinar a expressão gênica e proteica, respectivamente, dos dois genes-alvos. Em seguida, células da linhagem MC3T3-E1 serão transduzidas com os CRISPR-Cas9/gRNA relacionados às vias de Wnt canônica e não-canônica Wnt/Ca2+ previamente selecionados, na concentração pré-determinada. As transduções serão feitas da seguinte forma: (1) CRISPR-Cas9/gRNA para a via de Wnt canônica, (2) CRISPR-Cas9/gRNA para a via não-canônica Wnt/Ca2+, (3) CRISPR-Cas9/gRNA para as vias de Wnt canônica e não-canônica Wnt/Ca2+ ou (4) controle (CRISPR-Cas9 sem gRNA). As células transduzidas, e consequentemente com as vias de Wnt canônica e/ou não-canônica silenciadas, serão cultivadas sobre as superfícies de Ti com nanotopografia e controle para a avaliação de: (1) expressão de genes relacionados às vias de sinalização de Wnt canônica e não-canônica e dos marcadores osteoblásticos RUNX2, osterix (OSX), fosfatase alcalina (ALP) e osteocalcina (OC), por PCR em tempo real, (2) expressão proteica de RUNX2, por Western blot, e (3) atividade de ALP. Os dados quantitativos serão obtidos em quintuplicata (n=5) e submetidos ao teste de aderência à curva normal e homegeneidade de variâncias. Caso seja detectada normalidade dos dados, será aplicado o teste-t ou ANOVA (para comparação de 2 grupos e comparações múltiplas, respectivamente) ou se não, o teste Mann Whitney ou Kruskal-Wallis serão aplicados. O nível de significância adotado será de 5%. (AU)
FLORES ABUNA, RODRIGO PAOLO; OLIVEIRA, FABIOLA SINGARETTI; ADOLPHO, LETICIA FAUSTINO; FERNANDES, ROGER RODRIGO; ROSA, ADALBERTO LUIZ; BELOTI, MARCIO MATEUS. Frizzled 6 disruption suppresses osteoblast differentiation induced by nanotopography through the canonical Wnt signaling pathway. Journal of Cellular Physiology, APR 2020. Citações Web of Science: 0.
ABUNA, RODRIGO P. F.; OLIVEIRA, FABIOLA S.; LOPES, HELENA B.; FREITAS, GILEADE P.; FERNANDES, ROGER R.; ROSA, ADALBERTO L.; BELOTI, MARCIO M. The Wnt/beta-catenin signaling pathway is regulated by titanium with nanotopography to induce osteoblast differentiation. COLLOIDS AND SURFACES B-BIOINTERFACES, v. 184, DEC 1 2019. Citações Web of Science: 4.
SOUZA, ALANN T. P.; BEZERRA, BARBARA L. S.; OLIVEIRA, FABIOLA S.; FREITAS, GILEADE P.; BIGHETTI TREVISAN, RAYANA L.; OLIVEIRA, PAULO T.; ROSA, ADALBERTO L.; BELOTI, MARCIO M. Effect of bone morphogenetic protein 9 on osteoblast differentiation of cells grown on titanium with nanotopography. Journal of Cellular Biochemistry, v. 119, n. 10, p. 8441-8449, NOV 2018. Citações Web of Science: 3.