Arq. Bras. Cardiol. vol.97 no.4 São Paulo Oct. 2011 Epub Sep 30, 2011
https://doi.org/10.1590/S0066-782X2011005000091
Emiliano MedeiII; Juliana M. RaimundoI; José Hamilton M. NascimentoII; Margarete M. TrachezIII; Roberto T. SudoI; Gisele Zapata-SudoI
IPrograma de Desenvolvimento de Fármacos, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ
IIInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ
IIIRio de Janeiro, RJ; Serviço de Anestesiologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil
FUNDAMENTO: O tramadol é um analgésico de ação central cujo mecanismo de ação envolve a ativação de um receptor opioide. Anteriormente, mostramos que o tramadol e seus enantiômeros apresentavam um efeito inotrópico negativo sobre o músculo papilar no qual o (+)-enantiômero era mais potente que (-)- e (±)-tramadol.
OBJETIVO: No presente trabalho, investigamos os efeitos do tramadol e seus enantiômeros na corrente de cálcio tipo L (ICa-L).
MÉTODOS: Os experimentos foram realizados em miócitos ventriculares isolados de ratos Wistar utilizando a técnica de patch-clamp com configuração de célula inteira.
RESULTADOS: O tramadol (200 µM) reduziu a amplitude de pico do ICa-L em potenciais de 0 a +50 mV. Em 0 mV, a ICa-L foi reduzida em 33,7 ± 7,2%. (+)- e (-)-tramadol (200 µM) produziram uma inibição semelhante da ICa-L, na qual a amplitude do pico foi reduzida em 64,4 ± 2,8% e 68,9 ± 5,8%, respectivamente a 0 mV (P > 0,05). O tramadol, (+)- e (-)-tramadol mudaram a inativação de estado estacionário de ICa-L para potenciais de membrana mais negativos. Além disso, tramadol e (+)-tramadol alteraram significativamente a curva de recuperação dependente de tempo da ICa-L para a direita e reduziram a recuperação de ICa-L da inativação. A constante de tempo foi aumentada de 175,6 ± 18,6 a 305,0 ± 32,9 ms (P < 0,01) para o tramadol e de 248,1 ± 28,1 ms para 359,0 ± 23,8 ms (P < 0,05) para o (+)-tramadol. O agonista do receptor µ-opioide (DAMGO) não tem nenhum efeito na ICa-L.
CONCLUSÃO: A inibição da ICa-L induzida por tramadol e seus enantiômeros não teve relação com a ativação de receptores opioides e poderia explicar, pelo menos em parte, seu efeito inotrópico negativo cardíaco.
Palavras-chave: Tramadol, canais de cálcio tipo L, miócitos cardíacos, ratos.
O tramadol (1RS, 2RS), -2- [(dimetilamino) - metil] -1- (3-metoxifenil) - cloridrato de ciclohexanol é um analgésico sintético de ação central, com eficácia comparável a codeína, pentazocina ou dextropropoxifeno, quando utilizado para o alívio da dor1. O mecanismo de sua ação analgésica envolve uma combinação de ligação aos receptores µ-opioide. Esse duplo mecanismo de ação levou a uma descrição do tramadol como um agente opioide "atípico"2. O tramadol ((±)-tramadol) é formulado como uma mistura racêmica de (-)- e (+)-tramadol com diferentes ações farmacológicas. O (+)-tramadol possui alta afinidade com receptores µ-opioide, inibindo preferencialmente a recaptação da serotonina e promovendo um aumento na liberação de serotonina. No entanto, o (-)-tramadol possui baixa afinidade com receptor µ-opioide e inibe a recaptação de norepinefrina3. As ações complementares e sinérgicas dos dois enantiômeros melhoram o perfil analgésico da mistura racêmica4. O principal metabólito do tramadol, o O-desmetiltramadol contribui para o efeito analgésico porque possui uma afinidade 300 vezes maior com receptores µ-opioide que o tramadol5. Evidenciou-se que o tramadol afeta os receptores 5-HT6, muscarínico7,8, nicotínico9, NMDA e GABAA10. Além disso, os canais do K+ dependente de tensão e do Na+ estão envolvidos no efeito antinociceptivo e anestésico do tramadol, respectivamente11,12. Há informações limitadas sobre os efeitos do tramadol em sistemas que não sejam o sistema nervoso central. Ademais, poucos estudos compararam os efeitos do tramadol e seus enantiômeros. Em um estudo anterior, mostramos que o tramadol e seus enantiômeros induziam o relaxamento da aorta pré-contraída de ratos, que foi estereosseletiva de (+)-tramadol13. Além disso, mostramos que o tramadol reduziu a contratilidade do músculo cardíaco de ratos13. O possível mecanismo envolvido no fenômeno poderia ser a inibição da corrente de cálcio tipo L (ICa-L), relacionada com a ativação de um receptor que modula a ICa-L e/ou com um efeito direto no canal.
Para avaliar o papel dos canais de Ca2+ tipo L na ação inotrópica negativa cardíaca do tramadol e seus enantiômeros, investigamos os seus efeitos sobre as corrente de Ca2+ tipo L (ICa-L) em miócitos ventriculares de ratos. As comparações entre esses compostos foram conduzidas utilizando a concentração (200 µM), que tinha induzido efeito inotrópico negativo em músculos cardíacos de ratos13.
O Comitê de Cuidados e Usos de Animais na Universidade Federal do Rio de Janeiro aprovou os protocolos utilizados.
Isolamento de cardiomiócitos
Os corações de ratos Wistar machos (250-350 g) foram rapidamente removidos e montados em um sistema Langendorff modificado. Eles foram perfundidos retrogradamente através da aorta durante 5 min. a 10 ml.min-1 com solução de Tyrode oxigenada (em mM: 132,0 NaCl, 1,0 CaCl2, 1,2 MgCl2, 4,0 KCl, 10,0 HEPES, e 5,0 glicose; pH 7,3) a 33-35ºC. Os miócitos ventriculares foram enzimaticamente isolados após uma perfusão de 10 min. com solução nominalmente livre de Ca2+ contendo colagenase tipo II (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ; 150 U/mL). A enzima foi lavada por perfusão com solução de Tyrode livre de Ca2+-. Os miócitos isolados foram mantidos em solução de Kb (em mM: 1,0 de MgCl2, 30,0 de KCl, 10,0 de KH2PO4, 10,0 de HEPES, 10,0 de glicose, 70,0 de ácido glutâmico, 0,3 de EGTA, 20,0 de taurina; pH de 7,3) em temperatura ambiente até o uso. Eles foram colocados na câmara de registro montada sobre a mesa de um microscópio invertido (Axiovert 40 CFL, Zeiss) e perfundidos em 5 ml.min-1 com solução de Tyrode a 35ºC.
Os registros de correntes Ca2+ foram obtidos usando a configuração de célula inteira da técnica de patch-clamp14 através de um amplificador Axopatch de 200B (Axon Instruments, Cidade de Foster, CA). Os pulsos de tensão foram gerados pelo software pClamp e uma interface digital (Digidata 1200, Axon Instruments, Cidade de Foster, CA). As micropipetas foram preparadas com capilares de vidro borossilicato e apresentavam resistência de 4-7 MΩ, quando preenchidos com solução de pipeta (em mM: 110,0 CsCl, 5,0 ATP-Mg, 0,1 GTP, 10,0 EGTA, 10,0 HEPES e 30,0 TEA-Cl; pH de 7,1). As correntes foram filtradas com filtros de passagem baixa a 1 KHz e digitalizados a 2 KHz. As relações corrente-tensão foram determinadas através de degrau de tensão de 500 ms partindo de um potencial de membrana de -40 mV para potenciais de teste que variavam de -50 a +60 mV, em incrementos de 10 mV durante 500 ms 5 min. antes e depois da perfusão com tramadol de 200 µM. O valor de pico de ICa-L foi expresso relativamente à capacitância celular (pA/pF) e apresentado como uma média ± EPM. As curvas de ativação em estado estacionário (d) e inativação em estado estacionário (f) foram equipadas com uma função de Boltzmann: d (ou f) = 1/[1 + exp (Vm-V0.5)/k], na qual Vm era o potencial de membrana, V1/2 era o potencial de meia ativação/inativação máxima e k, o fator de inclinação.
O tramadol racêmico e seus enantiômeros foram generosamente doados pela Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos (Itapira, São Paulo, Brasil) e foram dissolvidos em água destilada a uma concentração de estoque de 50 mM. A colagenase tipo II, taurina, cloreto de tetraetilamônio (TEA-Cl), HEPES, ácido glutâmico, EGTA, CsCl, MgATP, GTP e tetrodotoxina (TTX) foram adquiridos da Sigma.
Os dados foram apresentados como média ± SEM. As comparações entre grupos foram realizadas utilizando a ANOVA DE UM FATOR com o teste de comparação múltipla de Bonferroni (pares de coluna selecionados). Enquanto as comparações intragrupo foram realizadas utilizando medidas repetidas de ANOVA DE UM FATOR com o teste de comparação múltipla de Bonferroni (pares de coluna selecionados). As diferenças estatísticas foram consideradas significativas quando p < 0,05.
Efeito do tramadol e enantiômeros na relação corrente-tensão de ICa-L
A figura 1A mostra um traçado representativo de correntes de Ca2+ internas registrado de miócitos ventriculares de ratos a 0 mV na ausência e presença de (±)-tramadol de 200 µM (Fig. 1 acima) e seus enantiômeros (Fig. 1 meio e abaixo). Os valores médios de ICa-L em diferentes potenciais (-50 a 60 mV) foram plotados em curvas I-V antes e depois do tratamento com (±)- (Fig. 1B acima), (+)- (Fig. 1B no meio) e (-)-tramadol (Fig. 1B abaixo). Após a perfusão de cada enantiômero, a amplitude do pico de ICa-L foi significativamente (p < 0,05) reduzida em potenciais mais despolarizados do que -20 mV, enquanto, com o (±)-tramadol, a redução foi significativa em potenciais mais positivos do que 0 mV (p <0.05). O (±)-tramadol inibiu significativamente a amplitude do pico de ICaL que foi reduzido em 33,7 ± 7,2% a 0 mV. Não houve diferença na inibição da corrente de pico induzida pela enantiômeros, (+)-tramadol (64,4 ± 2,8%) e (-)-tramadol (68,9 ± 5,8%). No entanto, a inibição da ICa-L induzida pelos dois enantiômeros foi significativamente maior do que a induzida pela (±)-tramadol (p < 0,01 vs (+)-tramadol; p < 0,001 (-)-tramadol). A redução foi parcialmente revertida após uma lavagem de 10 minutos.
Efeito do tramadol e enantiômeros na ativação de ICa-L
As curvas de ativação foram construídas com base na relação corrente-tensão, dividindo a amplitude da ICa-L em cada potencial pela força motriz (Fig. 2). O (±)-tramadol diminuiu o V1/2 da curva de ativação em estado estacionário da ICa-L, sem mudanças no valor de k. Na condição de controle, V1/2 era de -17,5 ± 2,1 mV e k era de 4,2 ± 0,2 mV e, na presença do (±)-tramadol, V1/2 era de -21,0 ± 2,2 mV (p < 0,05) e k era de 3,6 ± 0,3 mV (p > 0,05). Por outro lado, os enantiômeros não alteraram a curva de ativação em estado estacionário de ICa-L (Tab. 1).
*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005 comparado com o controle no mesmo grupo (medidas repetidas de ANOVA DE UM FATOR com pares de coluna selecionados comparados com o teste de Bonferroni). # p < 0,01, & p < 0,001 comparado com (±)-tramadol, comparação entre grupos (ANOVA DE UM FATOR com teste de comparação múltipla de Bonferroni de todos os pares de colunas). V1/2 - potencial de meia ativação/inativação máxima; k - fator de inclinação.
A inativação em estado estacionário da ICa-L foi medida utilizando um protocolo de pulso duplo clássico. Foram aplicadas etapas de pré-condicionamento de 1600 ms, de -60 a +60 mV, em intervalos de 10 mV a partir de um potencial de membrana de -40 mV, seguidas de um pulso de teste de 600 ms a 0 mV. A corrente de pico induzida por pulsos de teste foi normalizada à corrente máxima e plotada relativamente ao potencial de pré-condicionamento. O (±)-tramadol e seus enantiômeros alteraram as curva de inativação em estado estacionário para potenciais mais negativos (Fig. 3) e mudou o V1/2 da inativação (Tab. 1).
Na verdade, o V1/2 da inativação dos enantiômeros era significativamente diferente quando comparado com (±)-tramadol ((+)-tramadol p < 0,01 e (-)-tramadol p < 0,001 comparado com (±)-tramadol). No entanto, apenas o (-)-tramadol alterou o valor de k (controle, 3,8 ± 0,1 mV; (-)-Tramadol, 4,9 ± 0,3 mV; p < 0,01). Não foram observadas diferenças na média do valor de k entre os grupos.
Efeito do tramadol e enantiômeros na recuperação de ICa-L da inativação
Os efeitos do (±)-tramadol e seus enantiômeros na cinética de recuperação da ICa-L da inativação foram estudados utilizando um protocolo de pulso duplo que consiste em um pré-pulso de 500 ms a 0 mV, seguido de um pulso de teste de 500 ms a 0 mV, depois de um intervalo interpulsos variável (0 a 2.500 ms) de um potencial de membrana de -40 mV, a cada 10 s. O (±)- e (+)-tramadol alterou a curva de recuperação dependente do tempo para a direita e retardou a recuperação da inativação (Fig. 4). A recuperação da inativação poderia ser ajustada a um exponencial simples, onde a constante de tempo (t) era aumentada de 175,6 ± 18,6 ms a 305,0 ± 32,9 ms (p < 0,01) para (±)-tramadol e de 248,1 ± 28,1 ms a 359,0 ± 23,8 ms(p < 0,05)para (+)-tramadol. O (-)-tramadol não modificou o período para a recuperação do ICa-L. Não foram observadas diferenças na média do valor da constante de tempo (t)entre os grupos.
Efeito do agonista do receptor µ-opióide (DAMGO) na ICa-L dos cardiomiócitos dos ratos
No presente trabalho, nossos resultados mostraram que o tramadol e seus enantiômeros inibem a ICa-L. O possível mecanismo envolvido nesse efeito poderia ser um resultado da ativação dos receptores µ-opioide. Para verificar essa hipótese, efetuamos testes para averiguar se o agonista do receptor µ-opióide (DAMGO) modulava a ICa-L em cardiomiócitos de ratos. Dessa forma, a figura 5 mostra que o DAMGO não tem nenhum efeito sobre as correntes de cálcio ativadas por pulsos despolarizantes a 0 mV (Controle: -449,7 ± 4,4 pA vs DAMGO: -416,9 ± 2,7 pA; n = 3; p > 0,05).
No presente trabalho, nossos dados mostraram a diferença na eficácia dos enantiômeros tramadol para inibir a ICa-L (~ 60%) quando comparados com a mistura racêmica (~30%). Em contraste, no nosso trabalho anterior, o efeito inotrópico negativo sobre os músculos papilares de ratos observados a 200 µM apresentou a seguinte ordem de potência (IC50): (+)-tramadol > (-)-tramadol > (±)-tramadol13. Essa diferença entre as respostas da célula e do tecido poderia ser devida a uma possível inibição da recapturação de monoamina pelo tramadol e seus enantiômeros no músculo papilar estimulado eletricamente. Demonstrou-se que a liberação acionada eletricamente da noradrenalina pelas terminações nervosas simpáticas no músculo cardíaco isolado e a amplitude da contração são diminuídas por anestésicos locais15. Diferentes atividades do tramadol foram designadas como estereosseletivas, incluindo a ativação do receptor opioide3,16, a inibição da recapturação de monoamina17,18, o efeito analgésico3 e o relaxamento vascular13,19. No entanto, o presente estudo demonstrou que os enantiômeros do tramadol (200 µM) diminuíram ICa-L (~60%), indicando um bloqueio específico de um não enantiômero de canais de Ca2+ do tipo L. O tramadol racêmico produziu uma inibição de menor porte da ICa-L(~ 30%) quando comparado aos seus enantiômeros, o que poderia ser correlacionado com a pequena potência do racêmico na redução da contratilidade cardíaca13. O tramadol e os enantiômeros alteraram de maneira diferente a cinética do ICa-L. O (±)- e (+)-tramadol alterou a curva de inativação em estado estacionário da ICa-L para os potenciais de membrana mais negativos e retardou significativamente a recuperação de ICa-L da inativação. O (-)-tramadol alterou substancialmente apenas a inativação da ICa-L. Os efeitos do tramadol na ICa-L podem estar relacionados com a ativação de um receptor que modula a ICa-L e/ou a um efeito direto sobre o canal. No entanto, o efeito do tramadol na ICa-L parece não estar relacionado à ativação dos receptores opióides. O tramadol se liga preferencialmente a m-receptores, que foram demonstradas estar ausentes no coração de mamíferos20-23. De fato, os nossos resultados não mostraram efeito do antagonista de m-receptor DAMGO na ICa-L cardíaca. Além disso, foi demonstrado que os efeitos cardíacos dos opioides poderiam ser ou não dependentes de receptores opioides. Constatou-se que os efeitos da morfina sobre as correntes iônicas em miócitos cardíacos eram independentes do receptor opioide24 ou eram mediados por receptores de d e k25. No entanto, reconhece-se que o seu efeito cardioprotetor advém da ativação de receptores de d26,27. Estudos vêm mostrando que os opioides como o dextropropoxifeno, petidina e a leucina encefalina reduzem a ICa-L, mas que apenas a redução induzida pelo agonista do receptor de d (leucina encefalina) era bloqueada pela naxolona28,29. Os efeitos do tramadol em outras correntes iônicas também sugere um efeito direto nos canais de Ca2+ do tipo L. Haeseler e cols.12 mostraram que o tramadol, o sufentanil e o fentanil, mas não a morfina, bloqueiam os canais de Na+ neuronais expressos heterogeneamente por NaV1.2. É importante notar que a potência para bloquear a corrente de sódio era independente da potência do respectivo receptor opioide do composto. Também há relatos de que o tramadol bloqueia a corrente de K+ retificadora tardia (IK(DR) nas células neuronais NG108-15 de uma forma dependente de concentração30. Conforme observado em nosso estudo para a ICa-L, o tramadol alterou a curva de inativação em estado estacionário da IK IK(DR para potenciais mais negativos30.
A eficácia dos enantiômeros do tramadol na inibição da ICa-L foi o dobro do observado com o (±)-tramadol e esse efeito parece não estar relacionado com a ativação de receptores opioides.
Os autores agradecem à Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda. (BR), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, BR), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes, BR), Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB, BR), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (Faperj, BR) pelo apoio financeiro e pelas bolsas de estudos da Capes (para JMR) e CNPq (para GZS, RTS). Nenhum dos autores possui qualquer conflito de interesse ou interesse financeiro na divulgação.
O presente estudo foi parcialmente financiado pelo CNPq, CAPES e FAPERJ.
Este artigo é parte de dissertação de Doutorado de Juliana M. Raimundo pela Universidade Federal do Rio de Janeiro.
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Programa de Desenvolvimento de Fármacos, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de Ciências da Saúde, Instituto de Ciências Biomédicas