USP affiliated author: ASANO, KAREN MIYUKI - FMVZ
Subjects: CORONAVIRUS; ROTAVÍRUS ANIMAL; DIAGNÓSTICO; REAÇÃO EM CADEIA POR POLIMERASE; BOVINOS
Abstract: O coronavírus bovino (BCoV) e rotavírus (RV) são importantes agentes da diarréia neonatal bovina, causando grandes perdas econômicas. O BCoV é também responsável pela disenteria de inverno em vacas adultas e por desordens respiratórias e o RV possui um aspecto zoonótico de importância na saúde pública. Este estudo teve o objetivo de desenvolver uma multiplex hemi-nested RT-PCR para detecção simultânea de BCoV e RV do grupo A com a utilização de um controle interno. Para tanto, foram desenhados três primers dirigidos ao gene N de BCoV (306pb) e três primers dirigidos ao gene VP1 do RV do grupo A (228pb); para o controle interno, foram utilizados dois primers dirigidos ao mRNA do gene mitocondrial bovino ND5 (191pb). Foram utilizados como controles positivos a amostra Kakegawa de BCoV (título HA de 256), a amostra 8209 de rotavírus do grupo A (título viral de 101.66TCID50%/200µL) e suspensão de células MDBK para o controle interno. A extração de RNA foi realizada com o reagente comercial TRIzol, de acordo com as recomendações do fabricante. Foram realizados gradientes de temperatura para a determinação da temperatura ótima de hibridação para cada par de primers, resultando em 50ºC para PCR e 55ºC para a hemi-nested. Doze protocolos com diferentes concentrações de Taq DNA polymerase, MgCl2, primers e DNA-alvo foram testados. Para determinação do limiar de detecção, o protocolo final foi utilizado em diluições dos dois vírus em suspensão de amostras fecais negativaspara BCoV e RV adicionadas de 10% de suspensão de células MDBK, obtendo o limiar de detecção de 10-8 para os dois vírus e aplicado em amostras fecais de bezerros (53) e vacas adultas (22). Todas as amostras foram previamente testadas para BCoV por uma nested RT-PCR dirigida ao gene RdPd, sendo 15 positivas, e para rotavírus pela PAGE, sendo 3 positivas. Para a multiplex, 15 amostras foram positivas para BCoV ) e 6 para rotavírus. O seqüenciamento de DNA das amostras positivas para multiplex demonstrou a especificidade do teste. Uma concordância ótima foi encontrada para BCoV (0,833) e substancial para rotavírus (0,648) calculada pela estatística kappa, comparando-se com os testes de referência. Estes resultados demonstram que a padronização da multiplex foi eficiente para a detecção de BCoV e RV, com elevadas sensibilidade e especificidade. Além disso, o diagnóstico simultâneo dos dois agentes permite um diagnóstico rápido e a um menor custo devido à utilização de reduzidas quantidades de reagentes e mão de obra, fornecendo uma importante ferramenta para o diagnóstico e estudo da etiologia da diarréia em bovinos.
ASANO, Karen Miyuki. Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do grupo A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-nested RT-PCR. 2009. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-29012010-135615/. Acesso em: 05 jul. 2022.
Asano, K. M. (2009). Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do grupo A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-nested RT-PCR (Dissertação (Mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Recuperado de http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-29012010-135615/
Asano KM. Detecção simultânea de Coronavírus bovino e Rotavírus do grupo A em amostras fecais de bovinos utilizando uma multiplex hemi-nested RT-PCR [Internet]. 2009 ;[citado 2022 jul. 05 ] Available from: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-29012010-135615/