O matrimônio com Fernando foi celebrado em 25 de maio de 1521, em Linz, na Áustria. Na época, Fernando era governador das terras hereditárias dos Habsburgos em nome de seu irmão mais velho, o imperador Carlos V.
Em 29 de agosto de 1526, Luís II da Hungria, irmão de Ana, foi morto na Batalha de Mohács enfrentando Solimão, o Magnífico, do Império Otomano, sem deixar herdeiros. Sendo Ana a parenta mais próxima do rei falecido, em nome dela, Fernando reivindicou o direito à sucessão, e foi eleito Rei da Boêmia em 24 de outubro do mesmo ano.
Na Hungria, porém, não foi tão simples. De fato, Fernando foi proclamado rei por um grupo de nobres. A maior parte da nobreza húngara, no entanto, que não aceitava um soberano estrangeiro, elegeu um rei alternativo, João Zápolya, voivoda da Transilvânia, cuja esposa, Isabel Jagelão, era prima-irmã de Ana. O consequente conflito entre os dois rivais e seus sucessores durou até 1571, quando foi acertado o Tratado de Speyer, pelo qual o sucessor de Zapolya abdicou em favor dos Habsburgos.