Iniciou seus estudos num internato jesuíta no município paulista de Itu, e completou-os em São João del Rey, no Colégio São Francisco, onde teve um excelente professor. Padre Sacramento ia para o campo junto com os alunos observar e classificar plantas e animais – atividade que logo despertou no garoto Carlos o interesse pelas ciências naturais. Terminado o colégio, a mãe, com sua peculiar determinação, decidiu que ele deveria seguir o curso de engenheiro de minas. Na verdade, Carlos Chagas queria ser médico, como dois de seus tios; mas, para satisfazer Mariana Cândida, cedeu na escolha. Foi reprovado nos exames vestibulares. Na mesma época, adoeceu – alimentando-se mal, teve, ao que parece, carência de vitaminas – e voltou para casa. Tratou-o um dos tios médicos, e decerto as longas conversas que tiveram reforçaram em Carlos a vontade de seguir medicina. O tio e o avô encarregaram-se de convencer a mãe. Mariana levava mais fé na engenharia – coisa objetiva, “concreta” – do que em cuidar de doentes, mas acabou concordando.
Carlos Chagas foi aprovado para a então Faculdade de Medicina do Rio de Janeiro, que começou a cursar em 1897. Não conhecia o Rio, mas vários amigos, mineiros como ele, viviam na cidade. Um primo, Augusto das Chagas, era inclusive deputado federal.