M.F. Brito 1
T.T.C. Carvalho 1
G.R. Valle 1
L.F.L. Ferreira 1
J.V.M. Mambrini 2
M.R.J.M. Henry 3
M.I.V. Melo 1 *
1Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais - Betim, MG
2Consultor Estatístico - Belo Horizonte, MG
3Escola de Veterinária - Universidade Federal de Minas Gerais - Belo Horizonte, MG
Palavras-Chave: cão; criopreservação; radiação vermelha; CASA
Key words: dog; cryopreservation; red radiation; CASA
Para o sucesso da técnica de inseminação artificial, um fator determinante é a qualidade seminal pós-descongelamento. Dessa forma, são necessários alguns cuidados, como: adição de um bom diluidor, binômios de tempo e temperatura de congelação-descongelação corretos, armazenamento e manipulação adequados. Além disso, os últimos estudos têm apontado para a possibilidade de melhorar os parâmetros espermáticos e, assim, a qualidade do sêmen, por meio da radiação vermelha de baixa intensidade (Ocaña-Quero et al., 1997; Cohen et al., 1998; Corral-Baqués et al., 2005; Laffaldano et al., 2005; Laffaldano et al., 2007; Brandão, 2008).
O uso da radiação sobre células espermáticas foi proposto com o intuito de aumentar a motilidade de espermatozoides e, consequentemente, sua capacidade de fertilização. Acredita-se que a radiação interfira na cadeia respiratória das mitocôndrias, aumentando a produção de energia (ATP), bem como no conteúdo celular de aminoácidos livres, causando incremento de motilidade, induzindo reação acrossomal e reduzindo a mortalidade de células espermáticas in vitro (Ocaña-Quero et al., 1997; Laffaldano et al., 2007; Corral-Baqués et al., 2009).
O método de coleta realizado foi a manipulação peniana com auxílio de luva de palpação, cortada e vedada (com uso de seladora) de modo a formar um "cone", ao final do qual foi acoplado um tubo falcon acoplado (Valle et al., 2012). Por essa metodologia, as frações de sêmen foram coletadas até que se observasse a ejaculação da terceira fração, sendo o ejaculado imediatamente submetido à centrifugação. Coletou-se um ejaculado de cada cão, e cada ejaculado foi considerado uma repetição, totalizando oito repetições. Cada ejaculado foi centrifugado a 800G/15 minutos. Removeu-se o sobrenadante e realizou-se rediluição em meio Tris-Gema de ovo, aquecido a 37°C, com 6% de glicerol, visando ao volume final de 6mL.
Os tubos falcon foram colocados em becker de 50mL contendo 30mL de água à temperatura ambiente, a fim de retardar a queda de temperatura, proporcionando uma curva de resfriamento de 0,14°C/min. Após duas horas de curva, os tubos foram mantidos no vapor da caixa (5°C) para tempo de equilíbrio de 60min. Após esse tempo, as amostras foram envasadas em palhetas de 0,25mL e congeladas segundo metodologia descrita por Silva et al. (2003). As palhetas foram dispostas horizontalmente em uma caixa térmica de isopor contendo nitrogênio líquido por 10 minutos, a 5cm acima do nível de nitrogênio, e, então, mergulhadas no nitrogênio e armazenadas à temperatura de -196oC, mantidas por um período mínimo de sete dias antes de serem descongeladas. Todas as palhetas foram descongeladas a 38oC por 30 segundos.
Após a descongelação, as amostras também foram avaliadas quanto à longevidade espermática usando-se o teste de termorresistência (TTR) (Manual..., 1998), com leitura feita em sistema computadorizado de análise de sêmen nos tempos de 0min, 30min, 60min e 90min pós-descongelação. O equipamento utilizado foi o Sperm Class Analyser(r) (SCA(r)), acoplado a um microscópio de contraste de fase. No mínimo três imagens de cada amostra foram obtidas para análise. Os parâmetros de motilidade estudados foram: velocidade curvilinear (VCL), velocidade progressiva (VSL), velocidade média da trajetória (VAP), retilinearidade (STR), coeficiente linear (LIN), deslocamento lateral da cabeça (ALH), frequência de batimento flagelar cruzado (BCF), espermatozoides estáticos, com motilidade progressiva, não progressiva e total, espermatozoides de velocidade rápida, média e lenta.
As médias dos valores de MT, MP e V, analisadas subjetivamente após a coleta de sêmen, foram, respectivamente, 76,9±12,5%, 72,5±11,6% e 3,6±0,7. Após diluição e antes da incidência de radiação, os valores médios foram 73,1±10,7%, 66,9±11,3% e 3±0,6. Esses valores estão próximos dos valores descritos para a espécie canina em relação a sêmen fresco (Bueno, 2000).
Imediatamente após o descongelação (tempo 0 min), não houve diferença significativa entre os diferentes tratamentos (P>0,05), em nenhum dos parâmetros analisados pelo CASA (Tab. 1). Em estudo da incidência de radiação laser em sêmen de peru, Laffaldano et al. (2005) também não encontraram diferenças entre o grupo irradiado e o controle nas amostras avaliadas imediatamente após a incidência. Os autores atribuíram essa falta de efeito positivo ao fato de a bioestimulação requerer um período de tempo mínimo para que a célula possa obter do meio metabólitos essenciais, que são necessários às reações em que a irradiação está envolvida, percebido na leitura de motilidade. Entretanto, Corral-Baqués et al. (2009), ao analisarem sêmen fresco de cães irradiados com diferentes potências de laser He-Ne, numa dose de 3,34J/cm2, encontraram aumentos significativos nos valores de VCL, VSL, VAP, LIN e WOB, imediatamente após a incidência, sendo esta questão do efeito, ser imediato ou não, controversa.
Na Tab. 2, podem ser observadas diferenças entre os tratamentos com incidência de radiação antes do resfriamento e após a descongelação (T1) e o tratamento com incidência apenas antes do resfriamento (T2), na avaliação aos 30 minutos após a descongelação. Essas diferenças foram significativas nos parâmetros de MT, número de espermatozoides estáticos, motilidade não progressiva e espermatozoides lentos (p= 0,004). Esses resultados sugerem que a incidência de radiação antes do resfriamento e após a descongelação provoca efeitos deletérios na motilidade do espermatozoide canino em relação à incidência apenas antes do resfriamento. Acredita-se que esse achado seja devido a um processo de aceleração do envelhecimento da mitocôndria, por uma superestimulação da respiração mitocondrial, uma vez que a radiação luminosa provoca um aumento na produção de ATP (Laffaldano et al., 2005). Dessa forma, quando a célula espermática foi submetida a duas séries de radiação (mesmo que em momentos diferentes), foi observado significativo declínio da MT espermática ao longo do tempo (leitura aos 30 minutos após a incidência de radiação), reduzindo a velocidade de deslocamento e, inclusive, determinando maior percentual de morte celular, representado por um maior número de espermatozoides estáticos. O número de espermatozoides estáticos do grupo tratado com radiação antes do resfriamento e após a descongelação (T1) também foi significativamente maior que aqueles tratados sem a incidência de radiação (T4), reforçando a ideia de aceleração do envelhecimento mitocondrial.
Aos 60 e 90 minutos após a descongelação, não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos, em nenhum dos parâmetros analisados pelo CASA (Tab. 3 e 4). Resultados similares foram encontrados por Brandão (2008), que, ao analisar os efeitos da radiação laser sobre o sêmen de equino fresco e descongelado, também não encontrou diferenças estatísticas entre os parâmetros avaliados pelo CASA nos espermatozoides irradiados antes ou após a congelação e naqueles sem irradiação. Porém, diferenças numéricas puderam ser observadas em alguns parâmetros analisados, os quais serão destacados a seguir.
Em relação à frequência de batimento flagelar (BCF), numericamente, pôde-se observar que aqueles espermatozoides que foram incididos somente após a descongelação mantiveram maiores valores desse parâmetro aos 60 e 90 minutos após a descongelação, sem, entretanto, ser significativa. Sabe-se que o BCF está intimamente relacionado às taxas de fertilização in vitro, sobretudo nos estágios iniciais da fecundação (Silva et al., 2006). Brandão (2008), no entanto, em seu estudo com sêmen equino, sugeriu que o espermatozoide equino tem melhor aproveitamento da energia produzida pela célula quando apenas se incide radiação vermelha antes do resfriamento.
Em todos os tratamentos, observou-se queda de todos os parâmetros analisados pelo CASA ao longo do tempo de TTR, como também foi observado por Laffaldano et al. (2005), quando do armazenamento de sêmen de peru, e por Brandão (2008), quando da avaliação do sêmen equino descongelado. Essa queda pode ser atribuída a uma baixa resistência térmica do espermatozoide de cão, já relatada por outros autores, que não está ligada diretamente a baixas taxas de fertilidade (Olar, 1984; Strom et al., 1997). Nesse período, também ocorre a redução ou esgotamento de ATP decorrente do metabolismo espermático. Porém, ao serem analisados numericamente os parâmetros de velocidade do espermatozoide (VCL, VSL e VAP), descritos por Verstegen et al. (2002) e por Silva et al. (2006) como significativamente relacionados ao número de espermatozoides capazes de penetrar a zona pelúcida do oócito, ou seja, indicativos da capacitação espermática, pôde-se observar uma queda mais lenta desses parâmetros naqueles espermatozoides irradiados apenas antes do resfriamento (Tratamento 3) (Fig. 1, 2 e 3). Esse dado corrobora os apresentados por Laffaldano et al.(2005), que afirmaram que aplicação do laser, numa dose de 3,24J/cm2 em sêmen de peru armazenado por 60 horas, reduz a deterioração dos espermatozoides ao longo do tempo, tendo, portanto, efeito positivo na longevidade dos espermatozoides dessa espécie, fato que deve ser mais estudado em se tratando do efeito da aplicação do LED.
Brandão (2008) relata que a incidência de laser antes da congelação foi capaz de manter as características da célula durante o período de incubação, sugerindo que esse tratamento proporcionaria aos espermatozoides maior capacidade de suportar os estresses da criopreservação.
De forma similar, Corral-Baqués et al.(2005) demonstraram que o laser parece manter as características funcionais (VAP) do sêmen de cão, irradiado com diferentes doses de laser He-Ne, por pelo menos 45 minutos após a irradiação.
BRANDÃO, A.C. Efeito do laser diodo sobre as características de motilidade, de integridade de membranas plasmática e acrossomal e de pontencial de membrana mitocondrial de espermatozoides criopreservados de equinos. 2008. 87f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Pulo. [ Links ]
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