SciELO - Brazil - Quantificação das regiões organizadoras de nucléolo (NORs) como parâmetro para avaliar a proliferação das células da granulosa Quantificação das regiões organizadoras de nucléolo (NORs) como parâmetro para avaliar a proliferação das células da granulosa
Comunicação • Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 55 (1) • Fev 2003 • https://doi.org/10.1590/S0102-09352003000100019 copiar
Quantification of the nucleolar organizer regions (NORs) as a parameter to measure proliferation of granulosa cells
rat; ovary; granulosa cells; AgNORs
rato; oócito; célula da granulosa; AgNORs
[COMMICATION]
[Quantification of the nucleolar organizer regions (NORs) as a parameter to measure proliferation of granulosa cells]
C.M. Silva; R. Serakides; E.F. Nascimento; V.A Nunes; A.F.C. Ribeiro; N.M. Ocarino
Escola de Veterinária UFMG Caixa Postal 567 30123-970, Belo Horizonte, MG
Keywords: rat, ovary, granulosa cells, AgNORs
Palavras-chave: rato, oócito, célula da granulosa, AgNORs
Para se determinar o grau de proliferação celular várias técnicas têm sido utilizadas como a dos marcadores MIB-1, PCNA, Ki-67, a incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) (Bànkfalvi et al., 1999; Derenzini, 2000) e a avaliação morfológica com quantificação do número de regiões organizadoras de nucléolo argentafins (AgNORs) (Shiro et al., 1992; Pich et al., 2000). A quantificação das AgNORs é simples e menos onerosa em relação às demais técnicas e tem sido amplamente utilizada para caracterizar e diferenciar neoplasias e hiperplasias (Pich et al., 2000; Serakides et al., 1999), já que elas representam os marcadores da atividade dos genes ribossômicos e, portanto, da atividade nucleolar (Roussel, Hernandez-Verdum, 1994). A transcrição dos genes para RNA ribossômico (RNAr) envolve, além da RNA polimerase I, proteínas que formam partículas pré-ribossômicas, dando origem ao nucléolo (Ploton, 1994). Essas proteínas associadas às regiões organizadoras do nucléolo têm grande afinidade pela prata (Underwood, Giri, 1988), são chamadas AgNORs e observadas ao microscópio ótico como pontos pretos dispersos pelo núcleo ou pelo nucléolo (Treré, 1993).
No ovário, a quantificação das AgNORs tem sido feita para caracterizar e diferenciar o potencial proliferativo somente de células da granulosa neoplásicas (Trabucco et al., 1994; Zergeroglu et al., 2001). Não há registros do uso dessa técnica na determinação e diferenciação da taxa proliferativa de células da granulosa não neoplásicas presentes em folículos ovarianos em diferentes estádios do desenvolvimento. Assim, a quantificação das regiões organizadoras de nucléolo (AgNORs) pode ser utilizada como parâmetro para diferenciar o potencial proliferativo de células da granulosa e se constituiu no objetivo deste trabalho, conduzido em ovários de ratas adultas com seis meses de idade, todas em metaestro-diestro.
Desde o nascimento as ratas, submetidas às mesmas condições ambientes, foram alojadas em caixas plásticas, na densidade de duas ratas/caixa, receberam ração comercial e água destilada ad libitum e foram mantidas em regime de 12 horas com luz e 12 horas sem luz. Aos seis meses de idade, sete ratas foram sacrificadas e necropsiadas para a colheita dos ovários direito e esquerdo, colocados em formalina a 10% neutra e tamponada. Procedeu-se ao processamento histológico pela técnica de inclusão em parafina e microtomia para obtenção de cortes de 4m m. Os cortes histológicos foram impregnados pela prata para evidenciação das AgNORs, segundo a técnica descrita por Ploton et al. (1986) e modificada por Aubele et al. (1994). Após desparafinizados em xilol e hidratados em concentrações crescentes de álcool, os cortes foram corados com uma mistura de solução aquosa de nitrato de prata a 50% com solução de ácido fórmico a 1% contendo 2% de gelatina incolor. A incubação foi feita em câmara úmida e escura a 36 ºC for 20 minutos. Em seguida os cortes foram lavados em água deionizada e desidratados em concentrações crescentes de álcool.
Em uma secção histológica do ovário (direito ou esquerdo), sob objetiva de imersão, foram quantificadas as AgNORs em 60 núcleos das células da granulosa de folículos secundários com duas a três camadas de células ou com mais de cinco camadas de células da granulosa. O folículo secundário foi selecionado somente quando apresentava o oócito centrado sem a formação de antro. Somente foram quantificadas as AgNORs que se encontravam individualizadas como pontos pretos ou marrons. Quando se apresentavam agrupadas, foram registradas como uma única AgNOR conforme Crocker et al. (1989). Ao final obtiveram-se a média do número das AGNORs dos 60 núcleos das células dos folículos com duas a três camadas e a média dos folículos com mais de cinco camadas de cada um dos sete ovários. O delineamento experimental foi o inteiramente ao acaso, com dois grupos e sete repetições por grupo. Utilizou-se o teste t de Student (Sampaio, 1998) para comparação das médias.
Nos folículos secundários com duas a três camadas de células da granulosa as AgNORs eram grandes e estavam presentes em pequeno número (Fig. 1a). Nos folículos secundários mais desenvolvidos, as células da granulosa apresentavam AgNORs predominantemente pequenas, dispersas por todo o núcleo (Fig. 1b) e em número significativamente maior (Tab.1). Resultados de pesquisas verificaram correlação positiva entre o número de AgNORs e outros parâmetros da cinética celular que já estão bem estabelecidos como detectores da atividade proliferativa das células, tais como MIB-1, Ki-67, PCNA e incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) (Bànkfalvi et al., 1999; Derenzini, 2000). Sabe-se que quanto maior o número de AgNORs, maior a atividade proliferativa das células (Derenzini, Treré, 1994; Derenzini, 2000; Pich et al., 2000). Assim, o resultado não surpreende e reafirma que à medida que o folículo cresce, as células da granulosa proliferam em resposta aos estímulos endócrinos, parácrinos e autócrinos que atuam sobre elas durante a foliculogênese (Zeleznick, 1993; Fortune, 1994; Elvin, Matzuk, 1998; Salha et al., 1998). No entanto, o aumento da atividade proliferativa das células da granulosa com o avançar do desenvolvimento folicular, evidenciado pela quantificação das regiões organizadoras de nucléolo (AgNORs), atesta que essa técnica é um bom parâmetro para diferenciar o potencial proliferativo das células da granulosa também em processos não neoplásicos.
Recebido para publicação em 3 de maio de 2002
AUBELE, M.; BIESTERFELD, S.; DERENZINI, M. et al. Guidelines of AgNOR quantitation. Zentr. Pathol., v.140, p.107-108, 1994.
BÀNKFALVI, A.; ÖFNER, D.; SCHMID, K.W. et al. Standardized in situ AgNOR analysis in breast pathology: Diagnostic and cell kinetic implications. Pathol. Res.Pract., v.195, p.219-229, 1999.
DERENZINI, M.; TRERÉ, D. AgNOR proteins as a parameter of the rapidity of cell proliferation. Zentr. Pathol., v.140, p.7-10, 1994.
PICH, A.; CHIUSA, L.; MARGARIA, E. Prognostic relevance of AgNORs in tumor pathology. Micron, v.31, p.133-141, 2000.
PLOTON, D. Struture and molecular organization of nucleolus. Zentr. Pathol., v.140, p.3-6, 1994.
ROUSSEL, P.; HERNADEZ-VERDUM, D. Identification of AgNOR proteins, markers of proliferation related to ribossomal gene activity. Exp. Cell Res., v.214, p.465-472, 1994.
SALHA, O.; ABUSHEIKA, N.A.; SHARMA,V. Dynamics of human follicular growth and in-vitro oocyte maturation. Human Reprod. Update, v.4, p.816-832, 1998.
SERAKIDES, R.; NUNES, V.A.; SANTOS, R.L. et al. Histomorphometry and quantification of nucleolar regions in bovine thyroid containing methyltiouracil residues. Vet. Pathol, v.36, p.574-582, 1999.
SHIRO, T.; SEKI, T.; NAITOH, Y. et al. A correlation of argyrophilic nucleolar organizer regions with stages of hepatocellular carcinoma. Cancer, v.71, p.44-49, 1992.
TRABUCCO, S.; VARCACCIO-GAROFALO, G.; BOTTICELLA, M.A. et al. Expression of AgNORs in serous ovarian tumors. Eur. J. Oncol, v.15, p.222-229, 1994.
TRERÉ, D. AgNOR quantifification in tumor pathology: Wath is actually evaluated? J. Clin. Pathol., v.46, p.189, 1993.
UNDERWOOD, J.C.E.; GIRI, D.D. Nucleolar organizer regions as diagnostic discriminants for malignancy. J. Pathol., v.155, p.95-96, 1998.
ZELEZNIK, A.J. Dynamics of primate follicular growth. In: ADASHI, E.Y.; LEUNG, C.K. (Eds.). The Ovary New York: Reaven, 1993. p.42-55.
ZERGEROGLU, S.; AKSAKAL, O; DEMIRTURK, F. et al. Prognostic importance of nucleolar organizer region score in ovarian epithelial tumors. Gynecol. Obstet. Invest, v.51, p.60-63, 2001.