ReP USP - Detalhe do registro: Papel dos microRNAs na modulação de mecanismos moleculares da reprogramação e indução de pluripotência de células somáticas
Papel dos microRNAs na modulação de mecanismos moleculares da reprogramação e indução de pluripotência de células somáticas (2014)
USP affiliated author: FRÁGUAS, MARIANE SERRA - FMRP
Subjects: EXPRESSÃO GÊNICA; REPROGRAMAÇÃO NUCLEAR; RNA
Abstract: Células-tronco de pluripotência induzidas (iPSCs - induced pluripotent stem cells) são células geradas a partir da transdução viral de fatores de transcrição altamente expressos em células-tronco embrionárias - CTE (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc), em células somáticas. As iPSC são morfológica e funcionalmente semelhantes as CTE. No entanto, os mecanismos moleculares que levam à reprogramação nuclear ainda não estão muito bem esclarecidos. Dentre os mecanismos que auxiliam no processo de reprogramação nuclear, destacam-se estudos de modulação de vias de sinalização, uso de moléculas sintéticas, plasmídeos, proteínas recombinantes, e moléculas de RNAi. Assim, em nosso trabalho, demos ênfase à aplicação de moléculas sintéticas de microRNAS durante a reprogramação celular e estudar a modulação de vias de sinalização que inibem ou auxiliam este processo estocástico. Desta forma, inicialmente transfectamos células BJ1 e NT2 com pré e anti-miRs (29a, 145, 106a, 302b, Controle) e analisamos estes dados por microArray. Os dados obtidos foram validados por qRT-PCR. Em seguida, realizamos a modulação da reprogramação por miR29, em células humanas e de camundongos (MEFs-OG2). Observamos que a inibição de miR29a na fase inicial da reprogramação por OKS em MEFs-OG2, promove aumento no número de colônias, que pode ser em consequência da liberação de alvos reprimidos tais como Tet's, TDG, Dkk1 e Kremen2. Estes alvos irão agir na desmetilação ativa do DNA e repressão da via canônica WNT/βCatenina. Ao contrário, a super expressão de miR29 (pré-miR sintético) na fase inicial da reprogramação causou repressão dos alvos supracitados e repressão da formação de colônias Oct4-GFP+. Em seguida, visto que miR29 é reprimido por cMyc, visamos identificar a cinética dos alvos identificados durante a reprogramação por OKS, OKSM ou vetor vazio (controle). Identificamos queos mesmos alvos descritos acima foram regulados durante os 12 dias iniciais da reprogramação pelo vetor OKSM em relação aos demais. Este processo pode ser por intermédio da consequente inibição de miR29. Assim, a fim de confirmar o papel modulatório de miR29 na via WNT, realizamos ensaio de luciferase em fibroblastos MEF-OG2 contendo TCF/LEF repórter. Identificamos que miR29 promove a ativação da via WNT canônica nestes fibroblastos e esta ativação é independente de CHIR99021. Paralelamente, geramos colônias parcialmente reprogramadas com a transfecção de 4 miRs sintéticos (PM106a, PM302b, AM29a e AM145). Estas colônias foram caracterizadas por imunofluorescência (Oct4 e Sox2) e microArray, onde encontramos níveis aumentados dos componentes do complexo PRC2 (responsável pela metilação de genes de diferenciação celular). Ainda, foi realizada a reprogramação de fibroblastos humanos com o vetor policistrônico STEMCCA 4F em conjunto da transfecção de 4-miRs. Pudemos observar aumento de expressão gênica de Nanog, Oct4 e Myc para estas colônias, comparadas aos controles (4f e 4F miR-CTR). Por fim, foram utilizados diferentes tipos de coquetéis de drogas químicas para aumentar a obtenção de colônias; porém somente o conjunto NaBVC foi capaz de promover altos índices de colônias formadas e impedir a senescência celular. Este trabalho apresenta dados relevantes com relação à indução de pluripotência mediada por microRNAs. Mas também, igualmente apresenta dados relevantes sobre por quais caminhos os miRs aqui estudados agem durante este processo.
FRÁGUAS, Mariane Serra; ZAGO, Marco Antonio. Papel dos microRNAs na modulação de mecanismos moleculares da reprogramação e indução de pluripotência de células somáticas. 2014.Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014.
Fráguas, M. S., & Zago, M. A. (2014). Papel dos microRNAs na modulação de mecanismos moleculares da reprogramação e indução de pluripotência de células somáticas. Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
Fráguas MS, Zago MA. Papel dos microRNAs na modulação de mecanismos moleculares da reprogramação e indução de pluripotência de células somáticas. 2014 ;