A punção aspirativa permitiu a coleta de número adequado de células para a realização da técnica proposta. Houve necessidade de se realizarem testes para a indicação da temperatura mais adequada para anelamento dos primers MYC.S e Line.A, com o intuito de padronizar a reação da PCR. Assim, expusemos doze amostras de DNA de TVT a doze temperaturas diferentes, que variaram de 50 °C a 70,5 °C (Figura 2).
Realizou-se a corrida eletroforética das amostras, verificando que a amostra seis apresentou padrão de sonda de melhor qualidade quando exposta a temperatura de mais de 58,1 °C, definida como temperatura ótima para as ciclagens subsequentes. Também se variaram as quantidades da enzima Taq DNA polimerase nas reações, com o intuito de minimizar o gasto e maximizar os resultados.
A sensibilidade do teste para a detecção do rearranjo Line-l/MYC foi avaliada por meio do uso de diversas diluições de amostras. O DNA extraído de células de TVT foi diluído com DNA extraído de células de sangue de cães clinicamente sadios, na proporção de 1:25, 1:50 e 1:100. A reação para detecção do rearranjo se mostrou adequada para identificar células de TVT em todas as concentrações testadas, mesmo quando o DNA de células de TVT estava presente em uma proporção de 1:100 de células normais (Figura 3). Ainda, todas as vinte amostras testadas se mostraram positivas para a presença do rearranjo e nenhuma amostra de sangue de cão normal se mostrou positiva para o rearranjo, fato esse que comprova a especificidade da reação.
O método de punção para a coleta das amostras foi considerado adequado para a aplicação da PCR empregada neste trabalho. De fato, como já preconizado por outros autores, reduziu a contaminação por sangue e seus constituintes, conferindo alta celularidade, o que contribuiu com um melhor resultado da técnica molecular aplicada - no caso, a PCR25.
A conservação das amostras e a posterior extração do DNA apresentaram resultados satisfatórios quando comparados com os dos trabalhos que utilizaram procedimentos semelhantes26-28, tais como o armazenamento por longo período à temperatura de -20 °C, possibilitando a aplicação em futuras pesquisas.
Porém, esses autores não especificam em seus relatos qual seria o período máximo para armazenamento das amostras sem comprometimento da qualidade do DNA, dado de fundamental importância no artigo científico. O protocolo de extração utilizado por nós com a mesma temperatura - de -20 °C, por nove meses - não alterou a sensibilidade e a especificidade da PCR; consequentemente, obteve-se a detecção do Line-l/c-MYC em todas as vinte amostras 29. Diante disso, consideramos que nove meses é o tempo de armazenamento ideal para futuras pesquisas, dado até o momento não relatado na literatura especializada no assunto - o que mostra o ineditismo de nosso trabalho.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) demonstrou-se neste estudo um método de fácil execução, simples, rápido e de extrema sensibilidade para a detecção do rearranjo 11,30, em que se pôde obter grande quantidade de DNA de um gene específico a partir de uma quantidade mínima de DNA, como preconiza a literatura10. Com relação à padronização desse método molecular, obtivemos ótimos resultados quanto ao método de ciclagem das amostras quando várias temperaturas e números de ciclos foram testados, como realizado em outros estudos moleculares que utilizaram protocolos semelhantes29.
Quanto às diluições utilizadas de 1:25, 1:50 e 1:100, não foram encontradas na literatura tais diluições do DNA genômico para diminuição dos custos desse teste - cujo propósito foi averiguar a possibilidade de utilizá-lo em cães em final de tratamento, quando os métodos tradicionais não são capazes de detectar as células tumorais na região. O protocolo final alcançou o objetivo esperado, com boa definição em gel de agarose, o que reduz os custos do teste.
A detecção do rearranjo genético encontrado em nosso trabalho e o tamanho da amplificação, que foi de 340pb, diferiu de outros autores25,31 que verificaram tamanho da amplificação de 550pb para o segmento 5" do referido rearranjo, no qual a sequência do Line-1 possuía 1.3378pb flanqueados por 10pb em repetição direta upstream para o gene c-MYC. Entretanto, os produtos da PCR dos oligonucleotídeos variaram em comprimento, onde esse rearranjo encontrava-se em 416pb por uma sequência homóloga inversa. Essa variação pode ser explicada devido ao fato de a utilização de outros primers amplificar em uma região diferente. Para isso, é necessário aprofundar as investigações relativas a esse assunto.
Nossos resultados estão de acordo com a literatura especializada, em que se encontram relatos de outros pesquisadores que testaram por meio da PCR a amplificação desse segmento de DNA em outros tumores, constatando a ausência do rearranjo Line-l/c-MYC. No entanto, a literatura cita a necessidade de mais estudos para saber qual o verdadeiro papel desse evento na carcinogênese, bem como do mecanismo do elemento de transposição Line e seu verdadeiro papel no desenvolvimento da neoplasia32.
Concluiu-se que a técnica da PCR para detecção do rearranjo Line-l/c-MYC nas células de TVT canino espontâneo em cães, em amostras armazenadas em temperatura de -20 °C por nove meses, apresenta alto grau de especificidade para pesquisa do rearranjo genético em questão. São necessários mais estudos a respeito, pois a sensibilidade dessa alteração genética é indiscutível para a carcinogênese do TVT, como apresentado neste trabalho e unânime na literatura especializada, porém ainda não foi demonstrado que essa alteração seja a causa primária e única dessa neoplasia.

A invasão de ecossistemas brasileiros por espécies provenientes de outros biomas, países ou continentes é um desafio para os conservacionistas. Há vários exemplos, como os javalis originários da Europa e importados para fazendas no Uruguai, de onde escaparam para o Brasil nos anos 1990, alastrando-se desde então pelas regiões Sul e Sudeste. Entre os invasores há também anfíbios. Um grupo de biólogos das universidades paulistas acaba de publicar o primeiro levantamento de anfíbios invasores dos biomas brasileiros. Contabilizaram [...]

Arthur (Fábio Assunção) está tentando consertar seu relacionamento com Eliza (Marina Ruy Barbosa), e em cenas que começam a ser exibidas nesta quinta-feira (13) em Totalmente Demais, na Globo, começa levando um fora daqueles.
Disposto a recomeçar, Arthur não hesita em ir até a casa de Hugo (Orã Figueiredo), onde ela está hospedada para pedir perdão e com um bônus: pedi-la em casamento: "Eu tô completamente apaixonado por uma mulher e quero viver com ela até o fim. Essa mulher é você! E você não me respondeu ainda... Quer casar comigo?".
Enfática, Eliza afirma: "Não". O dono da Excalibur fica completamente desnorteado e tenta argumentar que vem tentando ser o príncipe que ela sempre sonhou, mas a modelo segue segura na decisão: "Eu não acredito mais em conto de fadas faz tempo. Eu não quero casar com você, Arthur, muito menos morar com você de novo".
Embora ela tenha falado a verdade, de que não aceita mais morar com o bon vivant, a ruiva surpreende e faz uma contraproposta: "Já faz um tempo que eu não acredito em conto de fadas, mas no nosso amor eu acredito".
"Me pede o que você quiser, eu estou aos seus pés", pede Arthur. "Eu não quero casar com você, muito menos voltar a morar com você de novo... Você quer namorar comigo", pede ela.
Quem vai elogiar Eliza é Germano (Humberto Martins): "Estou orgulhoso da sua maturidade. Você fez a coisa certa!".