Desenvolvimento de protótipo vacinais baseados em rBCG/SARS-CoV-2 | UFPel
Desenvolvimento de protótipo vacinais baseados em rBCG/SARS-CoV-2
16/11/2020 - 16/10/2024
O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) é o agente etiológico responsável pela doença respiratória aguda e infecção tipo pneumonia em humanos, denominada COVID-19 (coronavirus infectious disease 2019). A COVID-19, desde março de 2020, é considerada uma pandemia pela OMS. Assim, esforços urgentes voltados ao diagnóstico, tratamento e prevenção da infecção se fazem necessários. Nenhuma vacina está atualmente disponível no mercado para combater a infecção por SARS-CoV-2. Os principais alvos vacinais destacados na literatura são a proteína Spike (S) e a proteína de nucleocapsídeo viral (N), além de epítopos de células T e B preditos por ferramentas de bioinformática em outras proteínas do vírus. A vacina BCG, uma cepa atenuada de Mycobacterium bovis, mundialmente utilizada contra tuberculose e também empregada na imunoterapia contra câncer superficial de bexiga, está associada à indução de uma imunidade do tipo Th1, importante no combate à infecções virais, e também ao estímulo de uma proteção cruzada ou heteróloga contra outras doenças. A morbimortalidade por COVID-19 aparentemente é reduzida em países com vacinação universal com BCG implementada. Assim, essas propriedades podem ser exploradas utilizando BCG como vetor vacinal, expressando antígenos de diversos patógenos, incluindo SARS-CoV-2. Testes de eficácia de vacinas contra coronavírus são, em geral, realizados em modelo animal de camundongo. Assim sendo, o presente projeto visa a seleção de alvos vacinais e a construção de vacinas de BCG recombinante, as quais serão avaliadas inicialmente in vitro, quanto a expressão das proteínas em BCG recombinante, e o tipo de resposta imune induzida em uma linhagem de células de macrófagos humanos, para posteriormente avaliar em modelo animal de camundongo.
●	Este projeto tem como objetivo principal a construção e avaliação de cepas de Mycobacterium bovis BCG recombinante expressando antígenos de SARS-CoV-2 visando sua utilização como vacinas contra COVID-19.
Em 31 de dezembro de 2019, o primeiro caso de pneumonia de etiologia desconhecida foi relatado na cidade de Wuhan, província de Hubei, China. Para identificar a etiologia, uma série de possíveis agentes etiológicos foi apontada como possíveis causadores, como: SARS-CoV, MERS-CoV, vírus da influenza aviária e outros patógenos respiratórios comuns. Finalmente, um novo coronavírus, chamado temporariamente nCoV2019, foi identificado como o patógeno responsável pela doença descrita primeiramente na cidade chinesa de Wuhan (WHO, n.d.). A doença respiratória aguda e infecção tipo pneumonia em humanos foi denominada de COVID-19 (doença de coronavírus 2019), sendo o agente etiológico denominado de coronavirus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2). Devido ao crescente número de casos na China e em vários países do mundo, a OMS declarou a COVID-19 como uma emergência de saúde global, considerando-a como uma pandemia em março de 2020 (Shanmugaraj et al., 2020).
O SARS-CoV-2, responsável pela COVID-19, é um vírus RNA de fita simples envelopado, pertencente ao gênero Betacoronavirus (Chan et al., 2020; Lu et al., 2020). O genoma do coronavírus foi identificado a partir de dois casos de pneumonia durante o surto em Wuhan em 2019 (Chen et al., 2020), apresentando um tamanho de 29.881 pb. e compreendendo quatro proteínas estruturais: spike (S), nucleocapsídeo (N), envelope (E) e membrana (M) (Siddell et al., 2010) (figura 1). A proteína S é responsável pela ligação do vírus ao receptor ACE2 e fusão com a membrana celular (Kandeel et al., 2018), a proteína N interage com o RNA viral para formar a ribonucleoproteína, as proteínas E e M participam da montagem de novas partículas virais.
Figura 1: Estrutura viral de SARS-CoV-2. Fonte: autoria própria.
A análise filogenética indica que o SARS-CoV-2 está intimamente relacionado (com 88% de identidade) a dois coronavírus do tipo síndrome respiratória aguda (SARS) em morcego, SL-CoVZC45 e SL-CoVZXC21, coletados em 2018 em Zhoushan, leste da China , mas estavam mais distantes do SARS-CoV (cerca de 79%) e MERS-CoV (cerca de 50%) (Chen et al., 2020; Lu et al., 2020). Com base nos resultados de investigações genômicas e na presença de alguns morcegos e animais vivos no mercado de frutos do mar na cidade de Wuhan, o SARS-CoV-2 pode ter se originado de morcegos ou excrementos de morcegos associados a materiais contaminados no mercado ou nas proximidades (Zhou et al., 2020).
Com relação ao espectro clínico do COVID-19, ele varia entre doenças leves (como tosse seca, dor de garganta e febre) à síndrome respiratória aguda grave (SARS) com alto risco de mortalidade, desenvolvendo complicações fatais incluindo falência de órgãos, choque séptico, edema pulmonar, pneumonia grave e síndrome do desconforto respiratório agudo, necessitando de respiradores artificiais. As evidências atuais sugerem que pacientes com idade avançada, comorbidades preexistentes (como diabetes, hipertensão, doença cardiovascular, insuficiência renal e outras doenças respiratória como asma e bronquite) são consideradas grupos de risco para a infecção pelo SARS-CoV-2 (Lai et al., 2020; Rothe et al., 2020).
A pandemia de COVID-19 exige esforços rápidos e urgentes voltados ao diagnóstico, tratamento e prevenção da infecção. Até o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a infecção por SARS-CoV-2, as medidas de controle se baseiam em distanciamento social, isolamento de pacientes positivos e quarentena de indivíduos com suspeita de infecção. Ainda que essas intervenções tenham impacto importante para retardar a transmissão e minimizar a sobrecarga dos sistemas de saúde (Walker and et al., 2020), o número de casos confirmados e de mortes resultantes desta doença permanecem crescendo em escala exponencial no Brasil.
Nesse sentido, diferentes plataformas vacinais têm sido exploradas, alicerçadas em estratégias já avaliadas para SARS-CoV e MERS-CoV, incluindo vacinas baseadas em RNA mensageiro, DNA, "virus-like particles", subunidades recombinantes e vacinas vetorizadas, principalmente por vetores virais (Prompetchara et al., 2020). Uma das proteínas mais importantes na patogênese do COVID-19 é a proteína viral Spike (S) (Figura 1). O receptor para o coronavírus nas células hospedeiras humanas é a proteína da enzima de conversão da angiotensina 2 (ACE2) (16). Após a ligação ao receptor, a proteína Spike viral é clivada por proteólise dependente de ácido por catepsina, TMPRRS2 ou protease de furina, seguida pela fusão do envelope viral nas membranas celulares. Spike pode ser clivada em uma subunidade N-terminal S1 contendo o domínio de ligação ao receptor (RBD) e uma região C-terminal S2. Comparada a outras proteínas do coronavírus, a proteína Spike tem as sequências de aminoácidos mais variáveis que resultam da seleção positiva mais forte entre todos os genes do vírus para se adaptar a seus hospedeiros (Hu et al., 2017). O domínio de ligação ao receptor (RBD) na proteína Spike, localizada na membrana externa do coronavírus, medeia a ligação ao receptor ACE2 e desempenha um papel importante na entrada do vírus na célula hospedeira (Song et al., 2019). Essa proteína pode, portanto, ser usada como potencial candidato a vacina, pois é o principal alvo de anticorpos neutralizantes (Peiris et al., 2004). Além desses alvos, abordagens de imunoinformática tem mapeado diversos epítopos de linfócitos T e B em outras proteínas de SARS-CoV-2, para identificação, seleção e construção de outros potenciais antígenos vacinais(Baruah and Bose, 2020; Bhattacharya et al., 2020; Lucchese, 2020).
Sabe-se que, em geral, o combate a infecções virais é coordenado por uma resposta imune do tipo Th1 somado à indução de anticorpos neutralizantes (2). Assim, o uso de estratégias vacinais capazes de estimular esse tipo de resposta, parecem ser abordagens promissoras. A vacina BCG, uma cepa atenuada de Mycobacterium bovis, é mundialmente utilizada contra tuberculose (TB) (Bannon; and Finn, 1999; J. Li et al., 2020) e também empregada como um dos tratamentos de maior eficácia contra câncer superficial de bexiga (Alhunaidi and Zlotta, 2019). A vacinação com BCG induz, majoritariamente, uma resposta celular mediada por linfócitos Th1, além de aumentar significativamente a secreção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1B, que desempenha um papel vital na imunidade antiviral (Kleinnijenhuis et al., 2014).
Estudos têm sugerido que algumas das vacinas administradas rotineiramente em bebês e crianças, como a BCG, também tem efeitos não-específicos sobre o risco de doença e morte por outras condições, além daquelas para as quais as vacinas foram projetadas para prevenir. No caso de BCG, sua administração foi associada ao menor risco subsequente de doença e morte por outras causas, fato decorrente de mecanismos conhecidos por "trained immunity" e imunidade heteróloga (Higgins et al., 2016; Kleinnijenhuis et al., 2014). Um estudo demonstrou que a vacinação com BCG induziu reprogramação epigenética in vivo de monócitos contra infecção experimental com uma vacina atenuada contra o vírus da febre amarela com papel fundamental da IL-1b como mediador dessa resposta (Arts et al., 2018). Uma abordagem epidemiológica recente comparou políticas de vacinação com BCG em diversos países com taxas de morbimortalidade por COVID-19, demonstrando que países sem a vacinação universal com BCG implementada foram mais severamente afetados do que países com políticas universais de longa data (Miller et al., 2020).
A construção de cepas recombinantes de BCG que proporcionem maior estímulo do sistema imune tem sido explorada para melhorar sua eficácia contra TB (Nieuwenhuizen and Kaufmann, 2018), aumentar seu efeito antitumoral na terapêutica de tumores de bexiga (Begnini et al., 2015), e expressar antígenos de diferentes patógenos para emprego como vetor vacinal (Bastos et al., 2009; Zheng et al., 2015). Nesse contexto, salienta-se o potencial da construção e do uso de BCG como vetor vacinal expressando antígenos de SARS-CoV-2 como ferramenta profilática contra COVID-19.
Etapa I: Construção dos protótipos vacinais.
Seleção dos alvos vacinais
As sequências nucleotídicas que codificam para a proteína spike (S) e a proteína do nucleocapsídeo (N) de 2019-nCoV serão obtidas do NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (NC_045512.2). Genes sintéticos serão desenhados visando a clonagem das sequências completas das proteínas S e N, além das porções S1 (RBD) e S2 da proteína S. Além disso, duas sequências quiméricas serão obtidas através da seleção de epítopos de células B e T previamente descritos na literatura (Ahmad et al., 2020). Estes serão separados por ligantes específicos para proporcionar uma separação eficaz dos epítopos in vivo. Todas os genes sintéticos serão projetados com o auxílio do software Vector NTI 11 (Invitrogen™).
Desenvolvimento de banco/plataforma de vacinas recombinantes (rBCG/SARS-Cov2)
M. bovis BCG e de M. bovis BCG DleuD serão cultivados em meio 7H9 (líquido) ou 7H10 (sólido) com suplementação de OADC (Oleic Albumin Dextrose Catalase) além de suplementação com o antibiótico canamicina (50mg/mL) quando necessário, para de M. bovis BCG DleuD, 10mg/mL do aminoácido leucina será adicionado, quando necessário. O cultivo será mantido a 37ºC por 7 dias em meio 7H9 ou por 21 dias em meio 7H10. E. coli será cultivada em meio LB liquido ou LB-Agar a 37°C por 16 h, com suplementação do antibiótico canamicina (50mg/mL) quando necessário.
Expressão e purificação das proteínas recombinantes Spike, S1(RDB), S2, N e genes quiméricos de SARS-CoV-2
O gene spike (S), e as subunidades S1(RDB), S2, proteina N, bem como genes quiméricos (Q1, Q2 e Q3) e S2 serão sintetizados (Genome) e após subclonados no vetor de expressão em E. coli pAE (Ramos et al., 2004). Em seguida o produto da ligação será transformado por eletroporação em E.coli TOP10. Os clones recombinantes serão caracterizados enzimaticamente e por sequenciamento de DNA. A expressão das proteínas rS, rS1 e rS2 será realizada na cepa de E. coli BL21 e a indução será realizada com 1mM de IPTG. A confirmação da expressão será feita através de Western blot utilizando anticorpo monoclonal anti-6X-His conjugado com peroxidase (Sigma). A purificação será realizada por cromatografia de afinidade ao níquel em coluna de sepharose (HisTrap). A pureza das mesmas será determinada através de SDS-PAGE e a concentração de proteínas pelo Kit BCA (Pierce).
Construção de BCG expressando as proteínas Spike, S1(RDB), S2, N e genes quiméricos de SARS-CoV-2
O gene spike (S), e as subunidades S1(RDB), S2, proteína N, bem como genes quiméricos (Q1, Q2 e Q3) e S2 serão sintetizados (Genome) e após sub clonados nos vetores de expressão em M. bovis BCG (PUS2000 e PUS977) (Dellagostin et al. 1993) e no vetor pUP410 para expressão em M. bovis BCG DleuD (Borsuk et al. 2007). Em seguida o produto da ligação será transformado por eletroporação em E. coli TOP10 para obtenção dos clones recombinantes. Após a caracterização enzimática e do sequenciamento de DNA os clones recombinantes serão utilizados para transformação de M. bovis BCG ou M. bovis BCG DleuD por eletroporação. A avaliação de BCG recombinante expressando as proteínas será realizada por western blot utilizando anticorpos comerciais anti- RBD, anti-S e anti-N. Além disso, a avaliação será realizada por PCR real time para o mRNA espeficifico para as proteínas.
Etapa II- Ensaios pré-clínicos in vitro
Avaliação da resposta imune induzida por BCG recombinante em linhagem celular de macrófago
Os protótipos vacinais de BCG recombinante expressando as proteínas Spike, S1(RDB), S2, N e genes quiméricos (tabela 1) serão utilizados para co-cultivo com linagens de macrófagos humano e murino. O perfil imunológico in vitro de células imunes após tratamento com BCG recombinante será investigado por qRT-PCR. As células das linhagens J774A1 e THP1, de macrófagos murinos e humanos respectivamente, serão semeadas em placas de 6 poços numa densidade de 2 x 105 células por poço, e cultivadas a 37 °C numa atmosfera umidificada e controlada com 5% de CO2. As células serão incubadas com as cepas de BCG selvagem e recombinante (1 × 106) durante 3, 24 e 48 h. Após este período, as células serão lavadas com PBS e o RNA total será extraído utilizando TRIzol® (Invitrogen) e a síntese de cDNA será realizada com 1 µg de RNA utilizando o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems (Applied Biosystems) de acordo com o protocolo do fabricante. As reações de PCR em tempo real serão realizadas em aparelho Stratagene Mx3005P Real-Time PCR System (Agilent Technologies), utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK) e os primers (B-actina, GAPDH, RNA polymerase II, IL-1β, IL-6, TNF-α , BDNF total R, IL-12 e IL-4 F). Todas as reações serão realizadas em triplicatas. Os dados obtidos serão analisados utilizando o método 2–ΔΔCt, de acordo com Livak et al. (2001).
A COVID-19 (coronavirus infectious disease 2019) é considerada como uma pandemia mundial com mais de 43,1 milhões de pessoas infectadas pelo mundo e mais de 1,1 milhões de mortes desde janeiro de 2020. Desse modo, esforços voltados ao diagnóstico, tratamento e prevenção da infecção se fazem urgentemente necessários. Ate o momento, nenhuma vacina está disponível no mercado para combater a infecção por SARS-CoV-2. O projeto propõe a utilização da vacina BCG, que já é mundialmente utilizada contra tuberculose. A morbimortalidade por COVID-19 aparentemente foi reduzida em países que adotam a vacinação universal com BCG na população. Assim, essas propriedades podem ser exploradas utilizando BCG como vetor vacinal, expressando antígenos de SARS-CoV-2. Uma vacina eficaz que possa ser utilizada na profilaxia de COVID-19 tem importância e impacto mundial.