https://doi.org/10.1590/S0034-89102003000200013
Isolation of potencially pathogenic free-living amoebas in hospital dust
Maria Aparecida da SilvaI; João Aristeu da RosaII
IFaculdade de Farmácia e Bioquímica da Universidade do Oeste Paulista. Presidente Prudente, SP, Brasil
IIDepartamento de Ciências Biológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista. Araraquara, SP, Brasil
OBJETIVO: Observar a ocorrência de amebas de vida livre dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria em amostras de poeira coletadas em hospitais.
MÉTODOS: Foram coletadas 132 amostras de poeira em dois hospitais do município de Presidente Prudente, São Paulo. Os locais da coleta foram: Unidade de Terapia Intensiva, Centro Cirúrgico, Isolamento de Moléstias Infecciosas, Berçário, Emergência e Cozinha. As amostras foram semeadas em três meios de cultura: meio de ágar não nutriente com Escherichia coli, meio de ágar infusão de soja e microcultivo em meio de Pavlova modificado por Giazzi. As amebas isoladas foram identificadas segundo critérios morfológicos.
RESULTADOS: O índice geral de positividade para amebas de vida livre, potencialmente patogênicas, dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria, foi de 45,5%, sendo positivas 41,6% das amostras de poeira coletadas no hospital universitário e 50% no hospital estadual. Obtiveram-se 45,5% de positividade do gênero Acanthamoeba e 3,8% para amebas do gênero Naegleria.
CONCLUSÕES: As amebas de vida livre, potencialmente patogênicas, estavam presentes em todos os ambientes estudados dos dois hospitais, sendo que as espécies do gênero Acanthamoeba foram as isoladas com maior freqüência.
Descritores: Acanthamoeba, isolamento. Naegleria, isolamento. Hospitais. Amoeba. Poeira, análise. Infecção hospitalar, prevenção. Naegleria. Amebas de vida livre.
OBJECTIVE: To evaluate the occurrence of free-living amoebas of the genera Acanthamoeba and Naegleria is dust samples colleted in two hospitals.
METHODS: One-hundred and thirty-two dust samples were collected in two hospitals in Brazil. Hospital collection sites were the following: intensive care unit, operation rooms, nursery, kitchen, emergency and infectious diseases isolation room . The isolation of the amoebas was performed in three culture media: non-nutrient agar inoculated with Escherichia coli, soy agar, and microculture in Giazzi-modified Pavlova's medium. The amoebas were identified according to morphological criteria.
RESULTS: Amoebas of the genera Acanthamoeba and Naegleria were found in 45.5% of the samples, of which 41.6% were collected in the university hospital and 50% in the state hospital. Of all, 45.5% were positive for the genera Acanthamoeba and 3.8% for genera Naegleria.
CONCLUSIONS: Potentially pathogenic free-living amoebas were seen in all sites of the two hospitals and Acanthamoeba was the most frequently isolated genera.
Keywords: Acanthamoeba, isolation. Purification. Naegleria, isolation. Purification, hospitals. Amoeba. Dust, analysis. Cross infection. Prevention control. Naegleria. Free-living amoebas.
As amebas de vida livre constituem um grupo de protozoários de ampla dispersão ambiental, isoladas em praticamente todos os ambientes da água, do solo e do ar. Foram isoladas em todos os continentes, nas mais diversas altitudes. Resistem a extremas condições de temperatura e de pH, bem como ao cloro e a outros sistemas de desinfecção.
Durante muito tempo, o estudo das amebas de vida livre esteve restrito ao campo da zoologia, até que Fowler & Carter,8 em 1965, na Austrália, e Butt3 em 1966, nos Estados Unidos, relataram os primeiros casos de meningoencefalite fatal em humanos. Os casos foram atribuídos às amebas de vida livre.
Sabe-se hoje que algumas espécies de amebas de vida livre podem comportar-se como parasitas facultativos de seres humanos e de animais domésticos. Elas podem invadir o sistema nervoso central e outros órgãos, causando morte ou incapacidade permanente.9,11
Atualmente, as espécies de interesse médico são: Naegleria fowleri, várias espécies do gênero Acanthamoeba e Balamuthia mandrillaris. As principais doenças causadas por amebas de vida livre são:
a) Meningoencefalite amebiana primária - tem como agente etiológico Naegleria fowleri. É uma doença de evolução clínica rápida e fatal, que ocorre principalmente em crianças ou jovens sadios. A porta de entrada da ameba parece ser a cavidade nasal, por aspiração de água contaminada ou inalação de poeira contendo cistos amebianos. A via de invasão do sistema nervoso central é o epitélio neuro-olfativo.6,11
b) Encefalite amebiana granulomatosa - é uma doença de curso clínico prolongado, causada por várias espécies de amebas do gênero Acanthamoeba. As mais freqüentes são Acanthamoeba polyphaga, Acanthamoeba castellanii, Acanthamoeba culbertsoni, Acanthamoeba rhysodes, Acanthamoeba divionensis, além da Balamuthia mandrillaris.13
É considerada uma infecção oportunista, que ocorre principalmente em indivíduos debilitados, alcoólatras, doentes crônicos, pessoas submetidas a tratamento com drogas imunossupressoras e pacientes imunocomprometidos. A porta de entrada da ameba pode tanto ser o trato respiratório quanto úlceras de pele. A via de invasão do sistema nervoso central parece ser a hematogênica, embora possa ocorrer também por meio do epitélio neuro-olfativo.6,13 A Acanthamoeba pode causar também infecções disseminadas, principalmente em pacientes com Aids ou transplantados.1,14,18,20
c) Ceratite por Acanthamoeba - é uma infecção crônica da córnea, causada por várias espécies de Acanthamoeba. As mais isoladas são Acanthamoeba castellanii, Acanthamoeba polyphaga, Acanthamoeba culbertsoni, Acanthamoeba hatchetti, Acanthamoeba rhysodes e Acanthamoeba griffini. A infecção é mais freqüente entre usuários de lentes de contato. As lesões oculares ocorrem provavelmente por meio de um microtraumatismo do olho. A contaminação pode ocorrer pela água contaminada ou partículas do ar ou solo contendo cistos amebianos.19
No Brasil, apesar de já terem sido descritos casos de doença humana, poucos são os relatos da presença de amebas de vida livre no ambiente.4,5 Outro aspecto importante é a possibilidade de associação entre algumas espécies de amebas de vida livre e bactérias. Várias espécies de bactérias patogênicas, como Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Legionella spp, Listeria monocytogenes, entre outras, foram observadas no interior de amebas de vida livre.22
Baseado no fato de que essas e outras bactérias carreadas por amebas de vida livre são importantes causas de infecções hospitalares e também porque algumas espécies de amebas de vida livre podem causar infecções fatais, principalmente em indivíduos debilitados e imunocomprometidos, realizou-se estudo com o objetivo de verificar a ocorrência de amebas de vida livre dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria em amostras de poeira coletadas em hospitais.
Entre os meses de agosto e novembro de 2000, foram feitas doze coletas semanais consecutivas de amostras de poeira de várias áreas de dois hospitais, um universitário e um estadual, da cidade paulista de Presidente Prudente. Foram coletadas 132 amostras de poeira – 72 no hospital universitário e 60 no estadual. De cada um deles, foram coletadas 12 amostras das seguintes áreas: Unidade de Terapia Intensiva (UTI), Centro Cirúrgico (CC), Berçário (B), Cozinha (C) e Emergência (E). No hospital universitário, incluiu-se também a área Isolamento de Moléstias Infecciosas (MI).
Cada amostra de poeira foi coletada com dois swabs esterilizados, secos, que foram passados de forma aleatória sobre o piso e o mobiliário dos locais em estudo. Os swabs foram colocados em cálices contendo água destilada esterilizada, espremidos e descartados. O material foi deixado para sedimentação por duas horas.
Para o isolamento das amebas foram utilizados três meios de cultura: meio de ágar não nutriente a 1,5%, recoberto com uma suspensão de Escherichia coli mortas pelo calor, meio de ágar infusão de soja segundo Foronda7 (1979) e microcultivo em meio de Pavlova modificado por Giazzi9 (1996).
Foram colocadas no centro de duas placas de Petri três gotas do sedimento de cada cálice de sedimentação: uma contendo o meio de ágar não nutriente e outra o meio de ágar infusão de soja segundo Foronda7 (1979). As placas foram colocadas em sacos plásticos para evitar a dessecação e incubadas a 28ºC por até 14 dias.
A verificação do crescimento amebiano foi feita diariamente nas duas placas. O desenvolvimento das culturas foi acompanhado colocando-se a placa invertida sobre a platina de um microscópio comum. Para o estudo da morfologia das amebas, adicionou-se pequena quantidade de água destilada esterilizada sobre o crescimento. Uma gota desse líquido foi colocada entre lâmina e lamínula e observada ao microscópio com aumentos lineares de 100 e 400 vezes.
Quanto ao microcultivo em meio de Pavlova,9 colocou-se uma gota do sedimento sobre uma lâmina, adicionou-se algumas gotas do meio de cultura e cobriu-se com lamínula. A montagem foi incubada em câmara úmida à temperatura ambiente e examinada diariamente ao microscópio por até 14 dias, quando as amostras negativas foram descartadas.
A identificação das amebas foi feita pela observação de cistos e trofozoítos e baseada no tipo de movimento e nos critérios morfológicos de Page15 (1976). As amebas observadas com características morfológicas do gênero Naegleria foram submetidas à prova de flagelação para confirmação do gênero. Algumas amebas pertencentes a outros gêneros podem apresentar características morfológicas semelhantes, mas somente espécies de Naegleria possuem a capacidade de flagelação dentro das condições do teste.
Para a prova de flagelação, as amebas foram inoculadas no meio onde ocorreu seu isolamento e incubadas a 28ºC por 18h a 24h. O crescimento resultante foi coberto com água destilada esterilizada e incubado a 37ºC. A leitura foi feita, colocando-se uma gota do líquido entre lâmina e lamínula e observando-se, ao microscópio, o aparecimento de formas flageladas ativamente móveis. Essa leitura foi feita a cada 30 min por quatro horas.15,16
Foram isoladas amebas de vida livre potencialmente patogênicas em todos os ambientes estudados nos dois hospitais. As amebas foram identificadas até gênero segundo os critérios morfológicos de Page15 (1976).
Das 132 amostras de poeira coletadas nos dois hospitais, 60 (45,5%) foram positivas para amebas de vida livre, potencialmente patogênicas, dos gêneros Acanthamoeba ou Naegleria, e 72 (54,5%) foram negativas.
Das amostras de poeira coletadas, foram obtidos 65 isolados de amebas de vida livre potencialmente patogênicas. Em todas as amostras positivas, foram identificadas espécies como pertencentes ao gênero Acanthamoeba, o que corresponde a um porcentual de positividade de 45,5%. Espécies identificadas como pertencentes ao gênero Naegleria foram identificadas em cinco amostras de poeira, com 3,8% de positividade.
A Tabela mostra o número e a percentagem de amostras positivas e negativas para amebas de vida livre, potencialmente patogênicas, em cada área nos dois hospitais estudados.
No hospital universitário, das 30 amostras positivas, foram observadas espécies de Acanthamoeba em 26 (86,6%). Em quatro (13,4%), havia espécies de Acanthamoeba e Naegleria. No hospital estadual, das 30 amostras positivas, foram identificadas espécies de Acanthamoeba em 29 (96,6%), e espécies de Acanthamoeba e Naegleria em uma (3,4%) amostra.
Foram obtidos isolados de Acanthamoeba em todas as áreas estudadas, nos dois hospitais. No hospital universitário foram obtidos quatro isolados de Naegleria, sendo três em amostras de poeira da Cozinha e um do Centro Cirúrgico. No hospital estadual foi encontrado apenas um isolado de Naegleria em uma amostra de poeira do Berçário.
Amebas de vida livre são ubiqüitárias no ambiente. Espécies de Naegleria preferem ambientes aquáticos, natural ou artificialmente aquecidos, e o solo, enquanto espécies de Acanthamoeba ocorrem em qualquer ambiente. Balamuthia mandrillaris, única espécie desse gênero, responsabilizada por casos de infecção em humanos, ainda não foi isolada do ambiente.2,21
O encontro de amebas patogênicas no meio ambiente constitui somente um indicador da possibilidade de aquisição da parasitose. São pouco conhecidos os fatores que condicionam a ocorrência de infecção e doença. Para Page15 (1976), é evidente que muitas cepas não são patogênicas, ou muitas pessoas não são vulneráveis, ou circunstâncias especiais são necessárias para que ocorram as alterações patogênicas.
Os relatos sobre o isolamento de amebas de vida livre potencialmente patogênicas a partir de poeira são escassos. Assim, Kingston & Warhurst,10 em 1969, isolaram essas amebas da poeira e do ar de um quarto ocupado por crianças acometidas de infecção respiratória.
Giazzi9 (1996), estudando a prevalência de amebas de vida livre potencialmente patogênicas em vários habitats na cidade de Araraquara, São Paulo, coletou 23 amostras de poeira, obtendo um porcentual de 86,9% para espécies de Acanthamoeba, e de 39,1% para espécies de Naegleria.
Os índices obtidos no presente estudo, 45,5% para espécies de Acanthamoeba e 3,8% para espécies de Naegleria, foram bem menores do que os observados por Giazzi9 (1996), provavelmente porque as amostras de poeira foram coletadas em ambientes hospitalares, onde a circulação de pessoas é menor e também existe um cuidado maior com a limpeza.
Conforme resultados do presente estudo, foram isoladas espécies de amebas de vida livre potencialmente patogênicas em todos os ambientes estudados, nos dois hospitais, nas diversas áreas (Tabela). É preocupante a ocorrência dessas amebas, já que muitos pacientes internados em hospitais têm sua imunidade deprimida, seja naturalmente, devido a doenças ou a pouca idade ou, artificialmente, pelo uso de drogas imunossupressoras. Outros são submetidos a cirurgias ou podem, ainda, apresentar problemas de queimadura em áreas extensas da pele, o que pode facilitar a implantação de germes oportunistas, entre os quais, espécies de Acanthamoeba.
Apesar do número de amostras coletadas ser pequeno, analisando-se os dados da Tabela, observa-se que não há diferenças no número de isolados obtidos na Emergência, nem na Cozinha dos dois hospitais. No Berçário, a diferença observada se dá, provavelmente, pelo fato de que o hospital estadual é um hospital-maternidade, sendo, portanto, relativamente maior o número de pessoas circulando pelo ambiente.
O menor índice de positividade ocorreu no Centro Cirúrgico e na Unidade de Terapia Intensiva nos dois hospitais. Isso, provavelmente, se deve ao fato de que nesses locais, por abrigar pacientes de risco, além da maior preocupação com limpeza e desinfecção, o acesso de pessoas é normalmente restrito a poucos profissionais, que fazem uso de equipamentos de proteção individual, como luvas, máscaras, gorros, protetores de pés e roupas apropriadas e esterilizadas. Esses cuidados poderiam contribuir para a diminuição da contaminação desses ambientes, já que se sabe que espécies de Acanthamoeba têm sido isoladas como flora normal das vias aéreas superiores de indivíduos aparentemente saudáveis.12
O maior número de isolados de espécies do gênero Naegleria foi observado na Cozinha do hospital universitário, provavelmente pelo fato de que os cistos de Naegleria são pouco resistentes à dessecação, o que explica sua ausência do solo.17 Esses cistos ocorrem com freqüência em lama ou lodo. É facilitada a viabilidade dos cistos dessas amebas na cozinha, que pode permanecer molhada por períodos longos devido ao uso de água para o preparo dos alimentos e lavagem de utensílios.
Ao Professor Dr. João Flávio Giazzi, da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Araraquara, SP, pelas sugestões e pelo auxílio na identificação das amebas.
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Baseado na dissertação de mestrado apresentada na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista, Campus de Araraquara, em 2001