BDPI USP - Detalhe do registro: Na, K-ATPase recosntituída em lipossomos: padronização de um sistema unidirecionalmente reconstituído, sua caracterização cinética e aplicação em estudos fotoquímicos
USP affiliated authors: SANTOS, HERICA DE LIMA - FFCLRP
Subjects: LIPÍDEOS; PROTEÍNAS; BIOQUÍMICA; BIOFÍSICA (PROCESSOS;SISTEMAS)
Abstract: A reconstituição da Na,K-ATPase, após sua purificação, em sistemas lipídicos artificiais (lipossomos) é um excelente modelo para estudos dos aspectos funcionais e estruturais dessa proteína quando associada a membrana. A extração e quantificação dos fosfolipídios totais presentes na fração de membrana, obtida de rim de coelho, rica em Na,K-ATPase apresentou valores de cerca de 4,01 µmoles de fosfolipídios totais, bem como uma relação fosfolipídios/proteína total (p/p) de 0,16. A análise da composição lipídica revelou que a fosfatidilcolina (PC) é o fosfolipídio componente da membrana em maior quantidade contribuindo com cerca de 50% dos fosfolipídios totais. Além disso, as relações molares de colesterol total/ fosfolipídio e colesterol livre/ fosfolipídio obtida para o extrato natural de membrana foram 1 e 0,6, respectivamente. Para os estudos de reconstituição funcional da Na,K-ATPase em lipossomos foram estudadas diferentes relações lipídio:lipídio e lipídio:proteína, bem como os efeitos causados pela presença de colesterol e fosfolipídios com diferentes comprimentos e grau de saturação da cadeia de ácido graxo e diferentes grupo cabeça polar do fosfolipídio. Lipossomos constituídos de PC mostraram que tanto a porcentagem de reconstituição da Na,K-ATPase quanto o diâmetro médio dos proteolipossomos aumentaram proporcionalmente com o aumento da cadeia de ácido graxo atingindo um máximo com 16 carbonos, resultando em 75,1% e 319,4 nm, respectivamente: No entanto,aumentando-se o comprimento da cadeia de ácido graxo do fosfolipídio (18 carbonos) a reconstituição da enzima aos lipossomos torna-se menos efetiva. Para a família de fosfatidiletanolamina (PE), houve dificuldade na medida do diâmetro, devido alta dispersão e baixa estabilidade das vesículas, independente do tamanho da cadeia de ácido graxo do fosfolipídio empregado. Entretanto, a porcentagem de reconstituição em lipossomos constituídos de PE tem ... comportamento semelhante aos constituídos de PC, atingindo cerca de 64,9% de reconstituição da Na,K-ATPase para lipossomos de DPPE. Sistemas lipídicos binários com famílias de PC e PE revelaram ser eficientes na incorporação da Na,K-ATPase dependendo da relação lipídio:proteína empregada variando de 15 a 80% de recuperação da atividade ATPase total. Os melhores resultados de reconstituição da Na,K-ATPase, independente da mistura de PC e PE empregados, foram obtidos empregando-se relações lipídio:lipídio 1:1 (p/p) e lipídio:proteína 1:3 (p/p). Além disso, fixando-se a relação lipídio:lipídio e aumentando a relação lipídio:proteína ocorre uma significativa redução da incorporação de Na,K-ATPase. O mesmo efeito é observado fixando-se a relação lipídio:proteína e aumentando a relação lipídio:lipídio. A presença do colesterol na proporção molar de 2:2:5 de DPPC:DLOPE:colesterol ou DPPC:DPPE:colesterol resulta em uma melhora na reconstituição da Na,K-ATPase aos lipossomos, aumentando arecuperação de atividade ATPase total. Já com o aumento da porcentagem de colesterol a recuperação em atividade ATPase reduz significativamente. Os estudos de cinética de hidrólise do ATP, presença de inibidores e efeito-de perturbadores da membrana nos proteolipossomos revelaram que os sistemas vesiculares de DPPC:DPPE-Na,KATPase são sistemas íntegros, nos quais a enzima encontra-se orientada inside-out, na membrana dos lipossomos, isto é, de modo inverso a encontrada nos sistemas naturais. Nestes sistemas vesiculares a enzima é reconstituída com cerca de 78,9% de recuperação da atividade ATPase e 89% em proteína, com diâmetro médio de 140 nm. Os parâmetros cinéticos da Na,K-ATPase reconstituída sistema de lipossomos de DPPC:DPPE foram determinados em diferentes condições experimentais. A hidrólise do ATP, em pH 7,5 e condições saturantes de 'K POT.+', Mg²+ e 'Na POT.+' revelou duas classes de sítios de hidrólise um ... de alta afinidade ('K IND. 0,5'= 5,9 µM) e outro de baixa afinidade ('K IND. 0,5'= 0,4 mM) com cooperatividade negativa para ambos. A dependência da atividade ATPase da Na,K-ATPase reconstituída em relação à concentração dos íons Mg²+ em concentrações saturantes de ATP, 'K POT.+' e 'Na POT.+' estimulou a atividade Na,K-ATPase a valores de 127 U /mg com valor de 'K IND. 0,5' de 0,4 mM. A estimulação da atividade da enzima reconstituída pelos íons sódio extravesicular, em concentrações saturantes de ATP, Mg²+ e 'K POT.+' econcentração intravesicular de 150 mM de 'K POT. +', também apresentou somente uma única curva de saturação com 'V IND. m'= 147 U/mg e 'K IND. 0,5'= 0,2 mM com efeitos cooperativos (n= 0,2). A atividade foi estimulada pelos íons 'K POT. +' através de uma única curva de sítios de saturação. O valor obtido para 'K IND. 0,5' foi da ordem de 2,8 mM e também para este íon foram observados efeitos cooperativos (n=0,5) e o valor de 'V IND. m' obtido nestas condições experimentais foi da ordem de 171 V/mg. Para análise dos danos causados pelo oxigênio singlete produzido pela fotoirradiação do Rose bengal, na atividade da Na,K-ATPase, foram escolhidos dois sistemas vesiculares distintos: proteolipossomos constituídos de DPPC:DPPE e de DLOPC:DLOPE. A localização do Rose bengal, dentro da região aquosa dos proteolipossomos ou do lado externo, revelou ser determinante para à perda da atividade da enzima bem como da integridade do sistema vesicular. A atividade ATPase é afetada significativamente quando o Rose bengal está localizado no mesmo microambiente do sítio de hidrólise do ATP, entretanto outros estudos, monitorando-se a lipoperoxidação e o potencial de membrana poderão ser realizados para elucidar os mecanismos bioquímicos envolvidos durante a fotooxidação