Auxílio à pesquisa 06/04909-0 - Mitocôndrias, NADPH desidrogenase - BV FAPESP
Vias alternativas mitocondriais: estudos de NADH desidrogenase alternativa e oxidase alternativa em fungos
Processo: 06/04909-0
Assunto(s): Mitocôndrias NADPH desidrogenase Expressão gênica RNA interferente pequeno Fungos Aspergillus fumigatus
O Aspergillus fumigatus é um fungo saprofítico, amplamente distribuído no mundo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação de conídios do fungo, com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Muito pouco é conhecido sobre a nestes microrganismos. Estudos da respiração mitocondrial de A. fumigatus realizados em nosso laboratório, sugerem a presença de vias alternativas como a oxidase alternativa e a NADH desidrogenase alternativa (TUDELLA et al., 2004). Estas vias alternativas podem estar envolvidas na adaptação destes organismos em ambientes instáveis como estresse ao frio, estresse oxidativo e condições anaeróbias, os quais influenciam na expressão ou atividade destes componentes alternativos (AMORA et al., 2000; CALEGARIO et al., 2003). A NADH desidrogenase alternativa de A. fumigatus, é semelhante àquelas descritas em plantas, fungos, eubactérias e arqueobactérias. Sabe-se que sua atividade encontra-se estimulada durante a fase de crescimento da célula, porém seu papel fisiológico ainda é pouco conhecido (WACKWITZ et al., 1999). A possível resistência de inúmeros fungos a drogas que atuam sobre as mitocôndrias, tem sido atribuída à presença de uma oxidase alternativa que previne a autoxidação da ubiquinona reduzida e a subsequente formação de espécies reativas de oxigênio. O gene que codifica uma oxidase alternativa mitocondrial foi clonada e sequenciada no projeto n 02/01452-5. No projeto 05/51677-4, a seqüência de cDNA do gene foi clonada em plasmídeos pET28a(+) e pYES2 e expressa em dois sistemas heterólogos, um procarioto, E. coli RosettaTM (DE3)pLysS e um eucarioto, S. cerevisiae INVSc1. Em ambos os sistemas a oxidase alternativa expressa conferiu uma respiração resistente a cianeto. Esta característica herdada provocou uma discreta diminuição na taxa de crescimento, mas uma capacidade de sobrevivência na presença de KCN. Desta forma, a fim de se caracterizar molecularmente a função destas enzimas, será verificada o padrão de expressão do gene da NADH desidrogenase alternativa em diferentes meios de culturas, bem como sua clonagem e expressão heteróloga. Além disso, a função da oxidase alternativa será avaliada através da interferência de RNA em Aspergillus fumigatus. (AU)