http://dx.doi.org/10.1590/S0037-86822003000400011
Para o diagnóstico sorológico dos animais foram coletadas duas amostras de sangue periférico (orelha) em papel de filtro, de 40 cães do Município de Santa Maria (29o36'35"S 53o48'25"W, 151m a. n. m.), 11 de Itaara (29o36'35'"S 53o45'53"W, 425m a. n. m.), e 20 de Júlio de Castilhos (29o13'37" S 53o40'54" W, 513m a. n. m.), na maioria provenientes da vizinhança dos cães considerados como positivos. Foram também coletadas amostras de cães vadios dos municípios: Júlio de Castilhos (44), Cachoeira do Sul (30o02'21"S 52o53'38"W, 68m a. n. m.) (68) e Caçapava do Sul (30o30'44"S 53o29'29"W, 444m a. n. m.) (20). As duas amostras de cada cão foram examinadas por Imunofluorescência Indireta, de forma independente (ESS e VLS). Foi utilizada a pesquisa de anticorpos anti- Leishmania por imunofluorescência em sangue de todos os animais estudados utilizando Kit IFI – Leishmaniose Canina (Fundação Oswaldo Cruz/Biomanguinhos). Amostras de sangue de cães sabidamente positivos e negativos foram incluídos nos exames, em que a diluição inicial foi de 1:40 e final de 1:640. Soros de cães com títulos de imunofluorescência indireta (<1:40) foram testados em ensaios de ELISA utilizando antígeno purificado (Fundação Oswaldo Cruz/Biomanguinhos - Leishmania major). Blocos de vísceras de um sexto cão, também considerado como sugestivo na necropsia (D. Graça: comunicação pessoal) e cedidos por esta pesquisadora, foram cortados e submetidos à reação em cadeia de polimerase (PCR) específica para gênero Leishmania, conforme metodologia descrita anteriormente16. Resumidamente, 30 cortes de fragmentos parafinados foram coletados em tubo Eppendorf utilizando navalhas descartáveis individuais para cada caso. Após retirada de parafina com dois banhos de xilol, procedeu-se à extração utilizando kit comercial (Wizard Genomic kit, Promega, USA). O DNA isolado foi submetido a PCR utilizando oligonucleotídeos que amplificam a região conservada do minicírculo, e o produto amplificado foi analisado em gel de agarose 2%, transferido para membrana de náilon e hibridizado com sonda de L. braziliensis. O exame histológico foi realizado por coloração por hematoxilina- eosina e por PAS, respectivamente para pesquisa de amastigotas e de fungos.