Quimicando | Espectrofotometria UV/Visível (Fotocolorimetro)
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O método fotocolorimétrico foi desenvolvido com a finalidade de dosar substâncias biológicas. Neste método são utilizadas reações que resultam em soluções coloridas. A intensidade da cor produzida é proporcional à concentração da substância que está sendo dosada. Em consequência desta proporcionalidade, é possível dosar substâncias em soluções de concentração desconhecida (amostra), ao comparar a intensidade da cor produzida por esta substância à intensidade da cor produzida pela mesma substância em outra solução onde a concentração é previamente determinada (padrão).
A diferença de coloração é muitas vezes imperceptível a olho nu. A medida da intensidade de cor é efetuada por instrumentos denominados fotocolorímetros ou espectrofotômetros. Estes instrumentos possuem uma fonte de luz branca, filtros coloridos (fotocolorímetro), prismas ou retículos de difração (espectrofotômetro), através dos quais pode ser feita a seleção do comprimento de onda (λ), é uma sistema onde a intensidade da luz é detectada, transformada em corrente elétrica, amplificada e medida.
Ao incidir um feixe de luz sobre uma solução corada, verifica-se que a intensidade de luz que emerge da solução (I), é menor que a intensidade de luz incidente nesta solução (Io). A diferença entre a intensidade de luz de incide e a intensidade de luz que atravessa a solução corada pode ser medida e expressa pelo coeficiente obtido através da divisão da intensidade da luz emergente (I) pela intensidade da luz incidente (Io). Este coeficiente é chamado de transmitância (T). Por sua vez, mede-se a intensidade de luz absorvida por uma solução corada pela redução da medida da intensidade de luz transmitida. A medida de absorção é chamada de absorbância (A) ou extinção (E), logo A e T são inversamente proporcionais.
> concentração > intensidade de cor > Absorbância < Transmitância
A relação entre e concentração da substância e a absorbância é chamada de fator de calibração (FC). Fc = C/A.
A concentração de uma substância em uma determinada amostra pode ser determinada através da comparação da intensidade da cor obtida nesta amostra com a intensidade da cor produzida em uma solução padrão aplicando uma regra de três. Para evitar erros de aferição, não é utilizado um único padrão para realizar a comparação. É realizada uma série de determinações com concentrações crescentes da solução padrão, medindo as suas respectivas absorbâncias, a curva padrão. É calculado o fator de calibração para cada solução padrão e é feita uma média destes fatores, o fator de calibração médio (FCM). Os métodos fotocolorimétricos encontram grande aplicação em bioquímica sendo utilizados preferencialmente em relação a outros métodos, sempre que apresentarem grau de exatidão desejado, uma vez que permitem medidas rápidas e sensíveis. A sensibilidade é particularmente importante na determinação de pequenas quantidades de metabólitos e outras substâncias presentes em materiais biológicos.
Leis da fotometria
O princípio básico da fotometria é baseado no fato de que: partículas dispersas ou dissolvidas em uma solução interferem seletivamente com um raio de luz que passa através desta solução. Esta interferência depende dos seguintes fatores:
Cor do composto ou do tipo de ligação química presente;
Transparência da solução;
Combinação dos fatores acima.
Deste modo, as partículas podem absorver e transmitir parte do espectro, dependendo da sua concentração, da sua natureza química e/ou da sua cor.
Se pudermos medir o total de luz que incide (Io) sobre a solução de uma determinada substância e o total da luz transmitida (It), podemos avaliar o quanto a substância absorveu (absorbância: A).
A seguinte formulação pode ser feita:
Transmissão = It / Io (luz transmitida / luz incidente).
Observe que o termo transmissão tem aplicação limitada, uma vez que, a It é Io menos a luz que é absorvida não só pela substância que se deseja medir, mas também pelo solvente, pelo material da cubeta e por outras substâncias aí existentes. Assim, It é a luz transmitida após as absorções pela substância de interesse mais os interferentes. Para corrigir tal efeito, admite-se It =1 (100% de Transmitância) a luz transmitida após Io atravessar a cubeta contendo uma solução denominada branco. Este branco contém todos os componentes do meio, exceto a substância a ser medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o fototubo (fotocélula), a Transmitância = 0, ou seja, não há luz transmitida a ser medida.
Na prática, a transmitância (T), que é medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco na passagem da luz), é pouco utilizada, pois é substituída pelo valor de densidade óptica (D.O.) ou absorbância (A), termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitância:
A absorbância é, desta forma, medida em uma escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0).
A relação da A com a concentração da substância pode ser compreendida pelas Leis de Lambert-Beer: a absorbância de uma solução é proporcional à concentração da substância na solução e à distância percorrida pelo feixe luminoso que atravessa a solução (caminho óptico):
A = ε. l.c,
ε = coeficiente extinção molar, que é constante para cada substância, e definido como a absorbância (A) de uma solução l molar da substância em um determinado comprimento de onda (λ), numa cubeta de caminho óptico.
l = l cm (largura da cubeta) e
c = à concentração da solução.
Observe, portanto, que a absorbância é uma função linear da concentração. Assim, para uma mesma substância, considerando-se o caminho óptico constante, a A é diretamente proporcional à concentração desta substância. No entanto, as Leis de Lambert–Beer nem sempre são obedecidas. Algumas desobediências são conhecidas e atribuídas a fatores como: mudança na natureza do soluto, valores muitos altos ou muitos baixos das concentrações das soluções, etc. Também as presenças de ácidos, bases e sais na solução podem contribuir para essas desobediências, por estarem mais completamente dissociados, à medida que aumenta a diluição, visto que absorção da luz pelos íons é diferente daquela apresentada pelas moléculas não ionizadas. Para se evitar discrepâncias das Leis de Lambert-Beer, deve-se trabalhar com soluções mais diluídas e construir, previamente, uma curva padrão, em que são usadas concentrações conhecidas (e crescentes) da substância em análise, e verificar as absorbâncias no comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho óptico adequado.
Desta forma, teremos os limites de concentração nos quais a solução obedece às Leis de Lambert-Beer, ou seja, onde há linearidade. Com o emprego da curva padrão, podemos, também, determinar a concentração de uma solução problema. O comprimento de onda (λ) usado para a obtenção da curva padrão é obtido pela preparação do espectro de absorção da substância em estudo e é, normalmente, o λ onde a absorbância para a substância apresenta o valor máximo.