Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA genómico (RFLP'S) (Biologia) | e-escola
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Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA genómico (RFLP'S) Intermédio
A análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição do DNA genómico (RFLP's) explora as diferenças que existem ao nível das sequências de DNA. A análise do polimorfismo dos macrofragmentos de restrição separados por electroforese em campo pulsado (RFLP-PFGE) e a ribotipagem, baseada na hibridação DNA-DNA são as variações mais usadas desta técnica. Neste tópico aborda-se no que consiste cada uma das técnicas e o tipo de resultados gerados, bem como as suas aplicações, vantagens e limitações.
Análise dos ácidos nucleicos
Electroforese em campo pulsado
DNA cromossómico
Macrofragmentos de restrição
Caracterizar a técnica de RFLP's
Caracterizar a aplicação da técnica de RFLP's ao DNA cromossómico
Distinguir a análise do polimorfismo de macrofragmentos de restrição separados por electroforese em campo pulsado da ribotipagem baseada na hibridação DNA-DNA
Identificar o procedimento necessário à preparação das amostras de DNA para a aplicação da técnica de RFLP-PFGE
Enumerar as aplicações, vantagens e limitações da técnica de RFLP-PFGE
Descrever a preparação, as aplicações e as limitações da técnica de ribotipagem
Hibridação de Southern
A técnica de RFLP's (Restriction Fragment Length Polymorphisms) baseia-se na hidrólise do DNA com enzimas de restrição e posterior separação, por electroforese, dos fragmentos gerados, que correspondem a padrões de restrição específicos. Estes padrões podem ser característicos ao nível da espécie ou mesmo ao nível da estirpe.
Uma vez que estirpes distintas apresentam diferenças (ainda que, por vezes, mínimas) ao nível do genoma, o que esta técnica explora é a possibilidade dessas diferenças se encontrarem no interior da sequência de reconhecimento da(s) enzima(s) de restrição utilizada(s). Supondo que uma dada estirpe sofreu uma mutação tal que, uma dada enzima deixa de reconhecer a sua sequência de restrição nesse local, essa enzima deixa de poder cortar o DNA no dito local. Desta forma, a comparação dos perfis resultantes pode permitir detectar pequenas alterações que diferenciem as estirpes, desde que essas modificações ocorram nas sequências de reconhecimento das enzimas usadas.
A técnica de RFLP's pode ser aplicada:
ao DNA plasmídico, a qual é menos discriminatória por analisar apenas uma pequena parte do genoma e que está limitada às estirpes que exibem DNA plasmídico
ao DNA cromossómico, onde se encontra a totalidade da informação genética que é essencial em condições não selectivas.
A técnica de RFLP's aplicada ao DNA cromossómico é altamente reprodutível. No entanto, devido à dimensão do DNA cromossómico (tipicamente entre 800-8000 kb em bactérias), a maioria das enzimas de restrição gera um elevado número de fragmentos, impossibilitando a análise dos perfis. Para ultrapassar os problemas resultantes da complexidade dos perfis gerados por acção de enzimas que originam muitos fragmentos de restrição e da impossibilidade de migração electroforética de fragmentos muito grandes gerados por enzimas de corte pouco frequente, recorre-se à análise do polimorfismo de macrofragmentos de restrição separados por electroforese em campo pulsado (RFLP-PFGE). Pode ainda recorrer-se à combinação da técnica de RFLP com técnicas de hibridação que evidenciam regiões particulares do genoma. Existem várias variantes desta combinação, mas a mais utilizada e de maior interesse taxonómico e epidemiológico, é conhecida por ribotipagem.
No entanto, quer as técnicas de RFLP-PFGE quer a ribotipagem têm vindo a ser substituídas por técnicas de tipagem por PCR, essencialmente devido à elevada rapidez na obtenção de resultados, embora sem ganho no poder discriminatório do método.