Cromat. Líquida. Cromatografia Líquida. Fase Estacionária. Sílica: SiO 2. X H 2 O, também chamado do ácido silícico é a mais empregada. - PDF
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Lúcia Veiga Soares
1 Cromatografia Líquida Fase Estacionária Sílica: SiO 2. X H 2 O, também chamado do ácido silícico é a mais empregada. Alumina: Al 2 O 3. X H 2 O, também é largamente empregado. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 1
2 Cromatografia Líquida Fase Estacionária O grupo silanol Si O H é o sítio ativo de adsorção. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 2
3 Cromatografia Líquida Solventes A CL é baseada na partição do soluto entre as FM e FE. Pode-se entender a CL como uma cromatografia de adsorção, onde o soluto fica adsorvido na FE. O solvente (FM), compete com os solutos pelos sítios ativos de adsorção na FE. A capacidade de eluição dos solventes independe da natureza do soluto. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 3
4 Cromatografia Líquida Solventes A eluição é o deslocamento do soluto da FE pelo solvente. Quanto mais o solvente se ligar na FE, maior será sua força de eluição, consequentemente, menor a retenção do soluto na FE. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 4
5 Cromatografia Líquida Solventes Força Eluente É uma medida da energia e adsorção do solvente (FM), considerando o valor de pentano como zero. Quanto maior a força do eluente, mais rápido é a eluição do soluto através da coluna. Observem que as FE mais comuns (sílica e alumina) são POLARES. Logo... Quanto maior a polaridade de um solvente (FM), maior é sua força eluente. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 5
6 Cromatografia Líquida Solventes Série eluotrópica (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 6
7 Cromatografia Líquida Solventes Na CL também é comum um GRADIENTE (mudança) regular da força do eluente (análogo ao PLT do CG), em separações onde os componentes fracamente retidos são eluídos com um solvente de baixa força eluente. Em seguida, mistura-se um solvente ao primeiro, de modo a aumentar a força do eluente e os componentes mais fortemente adsorvidos são eluídos. OBS.: Uma pequena quantidade de um soluto polar já aumenta notavelmente a força eluente de um solvente apolar. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 7
8 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLAE High-Permormance Liquid Chromatography HPLC Técnica cromatográfica emprega elevadas pressões para forçar a passagem do solvente através de colunas fechadas que contêm partículas da ordem de micrômetros. Possibilita > eficiência de separação. Empregada na separação de moléculas que sejam solúveis na fase móvel. Espécies iônicas. Macromoléculas (elevada massa molecular). Moléculas com baixa estabilidade térmica. Adaptado de Carol H. Colins Fundamentos de Cromatografia 8
9 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLAE High-Permormance Liquid Chromatography HPLC 9
10 Componentes da CLAE 10
11 Esquema de um equipamento para HPLC 11
12 Sistema de Bombeamento 12
13 Colunas de HPLC Possui elevado custo e se degradam com facilidade devido a adsorção irreverssível de impurezas provenientes da amostra e do solvente. Necessita-se de reagentes de grau cromatográfico, que possuem elevado custo. A coluna é protegida por uma pré-coluna, que possui a mesma fase estacionária. A pré-coluna deve ser periodicamente substituída. 13
14 Colunas de HPLC Amostras devem ser filtradas antes da injeção, com o objetivo de remover as partículas, que, de outro modo, entupiriam o tubo e danificariam a bomba. Porosidade: 0,5 a 2 µm. 14
15 HPLC Fase Estacionária Cromatografia de Fase Normal Emprega uma FE POLAR e um solvente (FM) MENOS POLAR. A força eluente aumenta pela adição de um solvente mais polar. Cromatografia de Fase Reversa (mais comum) Emprega uma FE APOLAR ou menos polar e um solvente (FM) MAIS POLAR. A força eluente aumenta pela adição de um solvente menos polar (ou mais apolar). 15
16 HPLC Fase Estacionária Cromatografia de Fase Reversa Elimina a cauda dos picos, causada pela adsorção de compostos polares em sítios que adsorvem os solutos. É insensível a impurezas polares presentes no eluente, como a água. 16
17 HPLC Fase Estacionária As partículas microporosas de Sílica com diâmetros de 1,5 a 10 µm são o suporte sólido mais comum da FE. A cromatografia de partição líquido-líquido é feita com uma FE covalentemente ligada ao grupo silanol na superfície da sílica. 17
18 HPLC Fase Estacionária Estável entre ph 2 8. C 18 é a mais empregada em HPLC. 18
19 HPLC Fase Estacionária Fase Estacionária Quiral Isômeros ópticos são compostos cuja estrutura são imagens especulares uma da outra. Sendo assim, não podem ser sobrepostas. Estes compostos podem ser separados por cromatografia contendo uma FE contendo apenas um isômero óptico quimicamente ligado. Coluna Quiral. a) 3,5-dinitrobenzoilfenilglicina b) naftilalanina c) (S,S) Whelk-O 1 (Adaptado de Química Nova vol. 33. n 10. (2010) Fases estacionárias quirais para HPLC 19
20 HPLC Fase Estacionária Fase Estacionária Quiral 20
21 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLAE Sob condições ótimas de trabalho, a resolução aumenta com a diminuição das partículas da FE. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 21
22 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLAE A diminuição do tamanho das partículas permite que o soluto se difunda em uma menor distância para se estabelecer o equilíbrio entre as fases (FE e FM). Faz-se necessário uma maior pressão devido à resistência ao fluxo do solvente. (Adaptado de Harris Quantitative Chemical Analysis) 22
23 Sistema de Injeção de Amostras Devido às elevadas pressões de operação na coluna, são necessários técnicas especiais de injeção de amostra. Comumente, emprega-se VALVULAS DE INJEÇÃO, que contém alças (LOOP) de amostragem de aço permeáveis, que mantém os volumes fixos de 2 a 1000 µl. 23
24 Sistema de Injeção de Amostras Antes de serem injetadas, as amostras passam através de filtros com 0,2 a 2 µm de porosidade para remover as partículas que, de outro modo, entupiriam e danificariam a bomba. 24
25 HPLC Solventes Características Físico-Químicas Elevada pureza e/ou fácil purificação. Dissolver a amostra sem provocar sua decomposição. Não danificar a FE. Ter baixa viscosidade e PE. Ser compatível com o detector. Adaptado de Carol H. Colins Fundamentos de Cromatografia 25
26 HPLC Solventes Força Cromatográfica da FM Mede a capacidade da FM em interagir com os componentes da amostra. Solventes fortes diminuem a retenção e solventes fracos aumentam a retenção. 1 K 20 (ideal) ou 0,5 K 20 (componentes múltiplos) Adaptado de Carol H. Colins Fundamentos de Cromatografia 26
27 HPLC Solventes NP-HPLC (CLAE-FN) A FE é mais polar que a FM. Solventes polares são fortes e apolares são fracos. RP-HPLC (CLAE-FR) A FE é mais apolar que a FM. Solventes apolares são fortes e polares são fracos. Adaptado de Carol H. Colins Fundamentos de Cromatografia 27
28 Eluição Isocrática HPLC Solventes Eluição com apenas um solvente ou uma mistura de composição constante (ex. 50% ACN e 50% CH 3 OH). Um solvente pode ser insuficiente para promover uma separação adequada, ou ainda, pode ser insuficiente para proporcionar uma separação rápida de todos os componentes. Neste caso, emprega-se a eluição com gradiente. Eluição com Gradiente O solvente é continuamente alterado do mais fraco para o mais forte em termos de força eluente, através da adição de mais solvente forte ao solvente mais fraco durante a cromatografia. 28
29 HPLC Solventes Considere a separação em fase reversa. A força eluente aumenta quando a FM se torna mais polar. ACN é menos polar que a água 1) Álcool benzílico 2) fenol 3) 3-4 -dimetoxiacetofenona 4) Benzoína 5) Benzoato de etila 6) Tolueno 7) 2,6-dimetoxitolueno 8) metoxibifenila 29
30 HPLC Solventes Mal resolvidos para 2 e 3. 6 e 7 não estão bem resolvidos. Mal resolvidos para 2 e 3. Todos os picos estão resolvidos, mas a separação é muito lenta. 30
31 HPLC Solventes Todos os picos estão bem resolvidos, mas a separação é muito lenta. Uma maneira de aumentar a velocidade da separação e aumentar, gradativamente a força eluente. 31
32 HPLC Solventes 90% B 30% B 45% B 32
33 Solventes 33
34 Exercícios Qual cromatografia seria a mais adequada para separar os compostos abaixo? a) MF < 2000, solúvel em diclorometano. b) MF < 2000, solúvel em octano. c) MF > 2000, solúvel em água, não-iônico, tamanho de 50 µm. d) MF > 2000, solúvel em água, iônico. 34
38 HPLC Solventes Básico MTBE MeOH THF ACN CH 2 Cl 2 Ácido CHCl 3 Dipolar Triângulo de seletividade para os solventes em ( ) Fase Reversa e (-----) Fase Normal. 38
39 HPLC Solventes Exemplo: Ao realizar a separação de uma amostra empregando a FE no modo reverso e a FM MeOH:H 2 O :: 70:30 (v/v), obteve-se sobreposição de picos. Para que a sobreposição dos picos não aconteça, qual é a FM adequada e sua composição? DADOS: S MeOH = 2,6 S THF = 4,5 S ACN = 3,2 39
40 HPLC Solventes A força relativa de uma fase móvel pode ser descrita pelo ÍNDICE DE POLARIDADE DO SOLVENTE ( P ). P Total = Índices de polaridade do solvente. P A e P B = Índices de polaridade dos constituintes A e B, respectivamente. e = Fração de volume dos constituintes A e B, respectivamente. 40
41 HPLC Solventes Exemplo: Considerando uma mistura de 10 : 50 % (v/v) de ACN e H 2 O e outra de 25 : 75 % (v/v) de ACN e H 2 O, qual apresenta maior polaridade? Ou... Qual solvente possui maior poder de eluição em uma coluna de fase normal? E se fosse em uma comuna de fase reversa? DADOS: P água = 10,2 P ACN = 5,64 P total = (0,10 x 5,64) + (0,9 x 10,2) = 9,74 P total = (0,25 x 5,64) + (0,75 x 10,2) = 9,06 41
42 Detectores 42
43 Ultravioleta É o mais comum. Detectores Pode ser um sistema simples, que emprega lâmpada de Hg em 254 nm. Pode ser um sistema versátil, que emprega fontes de D 2 ou Xe e um monocromador. Proporciona maior seletividade. Sensível a espécies que apresentam elevada absortividade (ε ou a). Sensibilidade = 10 9 g/ml e Faixa Linear =
44 Ultravioleta Detectores 44
45 Detectores Índice de Refração Detector mais universal. Sensibilidade = 10 7 g/ml e Faixa Linear = O analito apresenta uma capacidade de refletir a luz diferente do solvente (FM). Assim, o detector mede a capacidade de um eluato em refletir a luz. Uma vez que a capacidade de refletir a luz é afetada pela composição do meio (neste caso, do solvente), não se aplica a eluição com gradiente, pois a linha de base sofrerá modificação após cada alteração. 45
46 Detectores Espalhamento de Luz por Evaporação O solvente é evaporado e o aerossol formado a partir de solutos não voláteis é detectado por espalhamento. Praticamente universal. A resposta do detector independe da estrutura do analito, mas de sua massa. O analito deve ser menor volátil que o soluto. 46
47 Detectores Espalhamento de Luz por Evaporação Considere a separação por HPLC em fase reversa de alguns componentes não voláteis extraídos de um drug tablet. CCl 3 COOH 0,01% m/v CH 3 CH 2 CH 2 OH 45% m/v + COOH 0,01% m/v Time Time 47
48 Detectores Aerossol Carregado Detector universal mais novo e sensível. É compatível com a eluição com gradiente. Após evaporação do solvente, o aerossol gerado a parir dos solutos não voláteis são misturados a uma corrente de N 2+, formando uma descarga de alta voltagem. As partículas adquirem cargas positiva e o N 2 + não adsorvido é separado por um campo elétrico, enquanto o aerossol é carregado para um coletor. O cromatograma descreve a carga que chega no coletor em função do tempo. Faixa Dinâmica ~ 5 ng a
49 Detectores Eletroquímico (Detector Amperométrico) Responde aos analitos que podem ser oxidados ou reduzidos em um eletrodo no qual um eluato passa. A corrente elétrica é proporcional à concentração do soluto. Na figura a seguir, a medida que os analitos (neste caso, os açúcares) são eluidos, eles são oxidados sobre a superfície de cobre. A redução da água (H 2 O + e ½ H 2 + OH ) ocorre no eletrodo de trabalho. Assim, a corrente elétrica que flui entre os eletrodos é proporcional a cada açúcar (analito) que sai da coluna. 49
50 Detectores Eletroquímico (Detector Amperométrico) 50
51 Fluorescência Detectores Responde aos analitos que fluorescem ou que podem se tornar fluorescentes por derivatização. O eluato é irradiado pelo detector em um comprimento de onda e mede a emissão em um comprimento de onda maior. A intensidade de emissão é proporcional à concentração do soluto. Na fluorescência ocorre a emissão de um fóton durante a transição entre estados de mesmo spin. Na fosforescência ocorre a emissão de um fóton durante a transição entre estados de spin diferentes. 51
52 Comparação Detectores 52
53 Detectores Espectrometria de Massas 53
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