Estrutura antigénica
Classificação antigénica e nomenclatura
Caso Hong Kong (1997)
Patogenia do vírus da gripe
Determinantes de patogenicidade
Ciclo de vida do vírus Influenza
Métodos de diagnóstico de infecção por vírus Influenza
Prevenção – vacinação
O vírus da gripe é o nome popularmente utilizado para a doença causada pelo vírus Influenza, e é uma das mais antigas e comuns doenças conhecidas pelo Homem.
O termo Influenza é a forma italiana do latim influencia, que se utilizou no século XV para designar epidemias atribuídas à influencia de estrelas, planetas e poderes ocultos(26). Os ingleses usaram este termo a partir do século XVII, enquanto os franceses, pela mesma época, preferiram o nome grippe, do qual deriva o nome português.
A infecção pelo vírus da gripe representa um impacto médico, epidemiológico e económico substancial. Os sintomas da gripe foram descritos pela primeira vez por Hipócrates no ano 412 a.c. e a primeira pandemia de gripe identificada ocorreu em 1580 (11). Desde então detectaram-se umas 31 pandemias de gripe, três das quais sucederam este século em 1918, 1957 e 1968 (28).
O impacto dramático da morbidade e da mortalidade associada ao vírus Influenza tem sido reconhecido desde pelo menos a época de Elizabete I de Inglaterra. Desde 1889 tem sido documentada uma mortalidade elevada referente a este vírus e a catastrófica pandemia de1918 confirmou que a gripe é efectivamente uma das últimas pragas mais importantes (21). A titulo de exemplo, morreram mais pessoas durante a pandemia de 1918-19 do que durante a 1ª Guerra Mundial e provavelmente muitas mais pessoas que a SIDA está a matar (25).
Com uma incidência anual de 5 a 20%, os surtos do vírus Influenza afecta anualmente uma proporção considerável da população. Estes tipos de surtos são traduzidos por milhões de dias perdidos, centenas de milhares de internações hospitalares, dezenas de milhares de óbitos e biliões de dólares em custos de atendimento à saúde. Nas pandemias, as quais ocorrem entre 10 a 40 anos, o impacto de Influenza pode ser ainda mais elevado. O recente surto de uma nova estirpe de vírus Influenza (H5N1) altamente patogenia em Hong Kong salienta a situação constante de risco.
O vírus Influenza (figura 1) pertence há ordem Mononegavirales, família Orthomyxoviridae, a qual é composta por três principais géneros: Influenza A, Influenza B e Influenza C.
Figura 1 – Microfotografia do vírus da gripe, onde é notória a presença das proteínas de superfície. Retirada de www.mayohealth.org/mayo/9910/htm/po991025b.htm
Os vírus Influenza A e B são os dois tipos de vírus Influenza que causam epidemias em humanos. O tipo A foi isolado pela primeira vez em 1933 enquanto o tipo B isolou-se em 1940. Estes dois tipos de vírus diferem em algumas das suas proteínas internas e nos tipos de hospedeiros. O tipo A infecta uma grande variedade de mamíferos como o homem, cavalos, focas e porcos, e aves como galinhas e patos. O tipo B só é capaz de infectar humanos, não tendo por isso tantas implicações na epidemiologia.
O vírus da gripe do tipo A é ainda subdividido em subtipos, baseado nas diferenças de duas proteínas virais de superfície do envelope lipídico, designadas de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA).
O tipo C do vírus da gripe tem características um pouco diferentes dos outros dois tipos e não tem importância patológica pois produz sintomas semelhantes a uma constipação comum ou, então, não produz quaisquer tipo de sintomas.
As partículas virais de Influenza (figura 2) apresentam-se de forma esférica ou filamentosa, com cerca de 80 a 120 nm de diâmetro no primeiro caso, e até 2000 nm de comprimento por 80 a 120 nm de diâmetro no segundo (16). Os viriões contém um genoma de RNA de cadeia simples negativa, de simetria helicoidal com diâmetro da nucleocápside de cerca de 9 nm. A superfície exterior do virião é protegido por um envelope lipídico.
Figura 2 – Esquema representativo da estrutura do virião do vírus de Influenza A. Adaptado de Flint S. J. et al; Principles of Virology, 2000
O genoma de RNA dos vírus de Influenza é constituído por 8 segmentos (7 em Influenza C), estando cada um deles fortemente associado a nucleoproteína (NP) formando uma nucleocápside helicoidal ou ribonucleoproteína (RNP) (16). Cada segmento de RNP (RNA + NP) está associada a uma RNA polimerase constituída por três polipéptidos, o polipéptido PB1, PB2 e PA (16).
A estrutura genómica deste vírus está conhecida em grande detalhe devido ao enorme trabalho de investigação genética (convencional e molecular) que tem sido feita. As principais funções de cada uma das proteínas resultante dos transcritos dos segmentos do vírus Influenza A encontram-se sumariadas na tabela 1.
Através da sequenciação do genoma verificou-se que as sequências terminais 5' e 3' de todos os segmentos genómicos são altamente conservadas (ver figura 3), vindo-se a verificar que isto era importante para a replicação do genoma e para a produção de mRNAs virais pois é o local de reconhecimento da proteína PB1 (5).
Tabela 1 – Principais funções das proteínas resultante dos transcritos dos 8 segmentos do genoma do vírus de Influenza A. Adaptado de www.micro.msb.le.ac.uk/335/orthomyxoviruses.html.
Subunidade de ligação ao cap
Subunidade de elongação
Subunidade importante na replicação do genoma (actividade proteica ?)
Hemaglutinina: glicoproteína de adesão ao receptor celular e de fusão
Nucleoproteína: maior componente da nucleo-cápside; importante no ciclo replicativo de RNA; conduz à ordenação helicoidal da nucleocápside
Neuraminidase: glicoproteína importante na libertação dos vírus
Proteína de matriz: maior componente do virião (proteína estrutural)
Canal iónico no envelope
Proteína não estrutural do núcleo: importante no transporte do RNA celular, splicing e tradução
Proteína não estrutural: função desconhecida
Figura 3 - Representação dos RNA genómicos e dos mRNA do vírus Influenza, mostrando as regiões conservadas terminais 3' e 5'. vRNA – RNA viral; cRNA – RNA complementar. Adaptado de www.micro.msb.le.ac.uk/335/orthomyxoviruses.html
O envelope é de natureza lipídica e deriva da membrana citoplasmática da célula hospedeira. Nesta, inclui-se proteínas víricas de protecção localizada na parte inferior do envelope – a proteína matriz 1 (M1). Esta proteína confere estabilidade ao virião e possibilita uma ligação química aos RNPs (12).
A membrana lipídica possui, também, proteína M2 a qual atravessa toda a espessura do envelope e funciona como canal iónico.
A partir do envelope projectam-se dois tipos de glicoproteínas, a HA e a NA. A hemaglutinina é responsável pela ligação do virião aos receptores das células alvo e é mediadora da fusão das membranas viral e celular. A neuraminidase é uma enzima envolvida na libertação de viriões recém-sintetizados pelas células infectadas pelo vírus Influenza.
As partículas virais de Influenza são relativamente lábeis, possuindo um tempo de meia vida de apenas algumas horas, e não são resistentes à secura (16).
Quando uma partícula viral entra em contacto com uma célula (figura 4), a hemaglutinina liga-se, pois esta possui afinidade para a ligação a uma mucoproteína que contém grupos terminais de ácido N-acetil neuraminico (NANA = ácido siálico). Esta ligação pode ser anulada pela acção da neuraminidase, prevenindo que o virião seja "sequestrado" por tipos de células inapropriados à sua replicação(16). Este tipo de polissacárido (NANA) é também muito comum nos mucos e a sua ligação à partícula viral iria neutralizá-la se não fosse a acção da neuraminidase (16).
A ligação da hemaglutinina aos receptores induz a entrada do vírus na célula por endocitose mediada por receptores formando-se um endossoma. Estes são acidificados pela célula até pH 5.0, e os monómeros de HA (proteína trimérica) são então clivados, levando à formação de um polipéptido HA1 e outro HA2 (16). Esta clivagem causa uma mudança conformacional na HA que induz a actividade de fusão de membrana do polipéptido HA2 (16). A combinação entre proximidade do envelope lipídico com a membrana do endossoma e a actividade de fusão de membrana do polipéptido HA2 resulta na fusão das duas membranas e a passagem das nucleocápsides para o citoplasma (16).
Figura 4 – Esquema simplificado do ciclo replicativo do virus de Influenza. . Adaptado de www.micro.msb.le.ac.uk/335/orthomyxoviruses.html
A diminuição do pH no endossoma activa também os canais iónicos, proteínas M2, as quais transportam iões H+ para dentro das partículas virais. Isto vai ajudar, também, ao desempacotamento deste, pois destabiliza as proteínas de matriz (M1) (16). Sequências especificas da nucleoproteína levam à translocação dos vários segmentos de RNPs para o núcleo (16).
Figura 5 – Síntese do mRNA viral pela RNA polimerase. Só as subunidades PB1 e PB2 são funcionais. Adaptado de Flint S. J. et al; Principles of Virology, 2000.
No núcleo os segmentos do genoma são transcritos pelos três polipéptidos da polime-rase de RNA associado a cada segmento. Durante a fase inicial de infecção (aproxima-damente duas horas) é necessário uma síntese activa de RNA pela célula hospedeira. A razão disto é que o passo inicial da replicação é a ligação do PB2 ao cap dos mRNAs do hospedeiro, e esta estrutura é clivada do restante mRNA pela PB2 (figura 5). O cap funciona como primer para a síntese de RNA, a qual é efectuada pela PB1 até encontrar o sinal existente no vRNA que determina a poliadenilação(figura 6). O sinal de poliadenilação é uma sequência de sete U, a qual é repetidamente copiada até se obter cerca de duzentos A (5). Findo este processo o mRNA viral é libertado possuindo um cap do mRNA celular e uma cauda poliadenilada. Devido ao sinal de poliadenilação, a parte homóloga ao vRNA deste mRNA possui menos 15 a 22 nucleótidos.
Figura 6 – Representação da elongação e da poliadenilação do mRNA viral. Adaptado de Flint S. J. et al; Principles of Virology, 2000.
No caso dos mRNA provenientes dos segmentos 7 e 8 pode ocorrer splicing levando à produção de M2 e NS2 (5). Todos os mRNAs são transportados para o citoplasma, os que codificam proteínas de membrana (HA, NA e M2) são traduzidos pelos ribossomas do retículo endoplasmático (ER), enquanto os restantes são traduzidos por ribossomas citoplasmáticos. Os produtos de transcrição do ER seguem a via normal de secreção do hospedeiro, sofrendo glicolisações no complexo de Golgi (figura 8). As proteínas PA, PB1, PB2, e NP são transportadas para o núcleo onde vão efectuar a síntese de cRNA e posteriormente de vRNA formando-se vários fragmentos de nucleocápsides (5). A acumulação de NP no núcleo induz o começo do ciclo replicativo do vRNA (5). Nesta situação (figura 7), tanto na produção do cRNA como no vRNA não é necessário um primer (logo não intervém a PB2) começando logo a PB1 a polimerização da cadeia complementar, onde há sucessivamente a adição de NP à cadeia nascente (5).
Figura 7 – Representação do ciclo replicativo do vRNA pela RNA polimerase. Só as subunidades PB1 e PA são funcionais, no entanto a função da PA ainda não é conhecida. Adaptado de Flint S. J. et al; Principles of Virology, 2000.
Neste processo de replicação é necessária a intervenção da subunidade PA não se conhecendo, no entanto, a sua função (5). Devido à adição de NP durante a síntese das novas cadeias, o sinal de poliadenilação não é reconhecido ocorrendo, assim, a síntese de todo o segmento (5). Entretanto, os novos vRNAs podem ser usados como moldes para a síntese de novos mRNAs virais (5). As proteínas M1 e NS1 são também transportadas para o núcleo e a ligação da proteína M1 aos novos vRNAs indicam a paragem da síntese de novos mRNAs virais (5). A proteína M1 em conjugação com a proteína NS1 induz a exportação das novas nucleocápsides para o citoplasma (5).
Figura 8 – Ciclo replicativo do vírus Influenza A. O vírus liga-se à proteína celular que contém resíduos de ácido siálico e entra por endocitose mediada por receptores (1). Após a acidificação do endossoma, a membrana deste e do envelope fundem-se libertando as nucleocápsides no citoplasma (2). Todos os segmentos são transportados para o núcleo (3). O vRNA é copiado usando a RNA polimerase viral em mRNA virais, usando os cap dos pré-mRNA do hospedeiro os quais são usados como primers para polimerização (4). Os mRNA são transportados para o citoplasma (5), mas para o caso dos mRNA que codificam a NS2 e a M2 ocorre ainda splicing (6). Os mRNA que codificam as proteínas de membrana (HA, NA, M2) são traduzidas pelos ribossomas do retículo endoplasmático (ER) (7). Estas proteínas entram na via de secreção do hospedeiro, podendo ocorrer glicolisações. Todos os outros mRNAs são traduzidos por ribossomas citoplasmáticos (8 e 9). As proteínas PA, PB1, PB2 e NP são importadas para o núcleo (10), onde catalisam a síntese de toda a cadeia (+) de RNAs (11) e depois a cadeia vírica (-) de RNAs (12), ambas sintetizadas sobre a forma de nucleocápsides. Algumas das novas cadeias (-) de RNA Figura 8 (continuação) - sintetizadas entram para a via de síntese de novos mRNAs (13). A proteína M1 e NS1 são transportadas para o núcleo (10). A ligação da proteína M1 a novos vRNAs induz a paragem da síntese de mRNAs virais e, em conjunto com a proteína NS2, promovem a exportação das nucleocápsides para o citoplasma (14). As proteínas HA, NA e M2 são transportadas para a superfície da célula (15) e são incorporadas na membrana plasmática (16). As nucleocápsides víricas associam-se com a proteína M1 (17), e proteína NS2 (18), são transportadas para a superfície celular e associam-se com as regiões da membrana plasmática que contém as proteínas de membrana. O empacotamento dos viriões é completado neste local pela incorporação (budding) da membrana plasmática (19). Adaptado de Flint S. J. et al; Principles of Virology, 2000.
No complexo de Golgi a proteína M2 recém sintetizada regula o pH, o qual é necessário para o transporte funcional da glicoproteína hemaglutinina para a membrana plasmática (20). As proteínas de membrana são então transportadas para a membrana plasmática, as quais junto com esta formarão posteriormente o envelope. As várias nucleocápsides virais associam-se com a proteína M1 e NS1, são transportadas para perto da membrana celular e associam-se com as regiões da membrana plasmática que contêm as proteínas de membrana. O empacotamento do vírus é completado pela incorporação (budding) da membrana plasmática, a qual ao fechar-se liberta o virião.
O mecanismo de empacotamento responsável pela escolha de 8 segmentos distintos numa só partícula é desconhecido (16). A neuraminidase tem uma função importante na libertação dos vários viriões (21).
Os vírus de Influenza, possuem duas grandes classes de antigénios: os internos e os superficiais.
Os antigénios internos são sobretudo a nucleoproteína e a proteína M1, constituindo os antigénios solúveis, e são específicos de cada tipo de Influenza (A ou B) (26).
Figura 9 – Estrutura tridimensional da hemaglutinina. Adaptado de www.uct.ac.za/depts/mmi/jmoodie/influen2.html.
Os antigénios superficiais, são a hemaglutinina e a neuraminidase. A HA é uma proteína trimérica, e de acordo com estudos de imunodifusão, reconhece-se agora a existência de 15 subtipos de HA, os quais diferem entre si na constituição aminoacídica, que se denominam de H1 a H15. Estes distribuem-se diferentemente entre as espécies, e somente três (H1, H2, e H3) foram encontrados no homem (figura 10).
Na estrutura terciária da hemaglutinina tem-se comprovado a existência de pelo menos quatro epítopos maiores com capacidade mutacional que se traduz em diferentes variantes de HA (figura 9).
O outro antigénio superficial, a NA, contém do mesmo modo subtipos desta proteína, neste caso só se identificaram nove, os quais se denominam de N1 a N9 (figura 10). Os subtipos que infectam o homem são o N1, N2 e o N8. Mais recentemente conheceu-se um caso de infecção por N5 em Hong Kong.
A – Hemaglutinina;
B – Neuraminidase
Figura 10 – Distribuição dos subtipos das proteínas de membrana do vírus Influenza A na natureza. Retirado de www.infogripe.com/tipos_de_virus/index.html
De acordo com os antigénios internos, nomeadamente NP, classifica-se os vírus influenza nos seus dois géneros, A ou B. O género A subdivide-se em subtipos de acordo com os antigénios superficiais (HA e NA). Assim de modo a denominar os vírus isolados, tem-se em contas as seguintes características:
Figura 11 – Nomemclatura do vírus Influenza A. Adaptado de www.infogripe.com/tipos_de_virus/index.html
- tipo de antigénio internos: A ou B;
- animal em que se isolou (se é de origem humana, omite-se este ponto);
- origem geográfica;
- número da estirpe do laboratório de origem;
- ano de isolamento;
- forma dos seus antigénios superficiais: subtipo H e subtipo N. No caso de tipos de vírus B, não existe este ponto.
Como exemplo, a pandemia de 1968 de Hong Kong, a qual se chamou H3 N2 aos antigénios de superfície, ficou com a seguinte designação: A/Hong Kong/8/68 (H3 N2). Por outro lado, à epidemia de Yamagata de 1988, designou-se de B/Yamagata/16/88.
Os vírus Influenza apresentam uma variação significante nas suas proteínas de superfície. Esta variação é especialmente importante do ponto de vista epidemiológico.
A variação antigénica, ocorre sobretudo no vírus influenza do tipo A, porém, também podem ocorrer no tipo B. No entanto, este apresenta uma maior estabilidade antigénica, já que o tipo B possui um único reservatório (21).
Sendo assim, ocorrem dois tipos de variação (15). A mutação antigénica minor (drift) dá-se devido a acumulações estáveis de mutações que alteram o tipo de aminoácidos nos epítopos das proteínas. Este tipo de variação ocorre tanto na HA, como na NA. Estas alterações reduzem a ligação aos anticorpos, reduzindo consequentemente a imunidade pré-existente do hospedeiro, facilitando assim a disseminação de Influenza, dando origem a uma nova epidemia.
A mutação antigénica major (shift) ocorre quando há uma alteração dramática das proteínas de superfície, HA e/ou NA dos vírus da influenza tipo A (figura 12). Estes tipos de alterações ocorrem devido a uma substituição de todo o segmento genético viral, por outro segmento (da mesma proteína), sobretudo de vírus Influenza de um animal (por exemplo uma ave). Isto acontece quando duas estirpes virais diferentes invadem uma mesma célula hospedeira, pois durante o empacotamento pode ocorrer rearranjos levando a que um virião possua segmentos de duas estirpes diferentes. Visto que a população apresenta pequena ou nenhuma imunidade para estas novas estirpes, elas ocasionam pandemias associadas a morbidade e mortalidade inevitavelmente elevadas (21).
Figura 12 – Esquema representativo da variação antigénica drift e shift. Adaptado de www.micro.msb.le.ac.uk/335/orthomyxoviruses.html.
Mais recentemente descobriu-se que pode ocorrer um novo tipo de shift antigénico. Isto acontece quando um tipo de vírus Influenza animal, que previamente não era capaz de infectar humanos, torna-se capaz de os infectar (13).
Além do drift e do shift antigénico, o reaparecimento de uma estirpe antiga de vírus, é uma causa potencial de novos surtos.
Uma estirpe de Influenza que anteriormente era conhecida como infectante de aves, a qual se descobriu na África do Sul em 1961(11), foi associada a um caso de infecção em humanos em Hong kong em 1997 (24).
Em Maio desse ano, uma criança com treze anos morreu devido a uma infecção com esta estirpe de Influenza A (H5 N1) (24). Depois do aparecimento do primeiro caso, uma vigilância intensiva revelou a existência de outros dezassete casos em Hong Kong até ao final desse ano (11).
Este vírus que matou seis pessoas em Hong Kong em 1997, não era no entanto capaz de se transmitir entre humanos, havendo apenas a transmissão de aves para humanos - um fenómeno nunca visto anteriormente (16). Caso a transmissão pudesse ocorrer entre humanos, teríamos estado provavelmente face a uma pandemia.
A virulência de uma estirpe viral de Influenza é expressa na sua infecciosidade a um determinado sistema celular ou tecido e na sua transmissibilidade ou capacidade de difusão no hospedeiro, no caso da gripe do tipo A na sua gama de hospedeiros (26).
A HA , é a principal responsável do poder patogénico dos vírus da gripe. Esta só é patogénico na forma activa da HA. A sua activação resulta da sua fragmentação proteolítica em dois polipéptidos (HA1, HA2) por enzimas celulares semelhantes á tripsina (26).
Este tipo de proteases são comuns nas vias do sistema respiratório, não se encontrando nas outras células do organismo. É por esta razão que a gripe é uma doença respiratória.
No entanto, há outras estirpes de Influenza que possuem uma infecciosidade muito mais ampla, sendo capazes de infectar todas as células do corpo, pois a proteólise da HA depende de outra enzima, a plasmina, e esta está presente em todos os tipos de células (16).
Mais recentemente, descobriu-se um novo mecanismo de aquisição de virulência por parte de estirpes humanas de Influenza A. Goto e Kawaoka, demonstraram que a NA liga-se e sequestra plasminogénio levando a uma maior concentração local deste percursor de proteases, ocasionando assim o aumento da clivagem da HA.(8).
A NA intervém também no processo de infecciosidade, principalmente no processo de libertação do vírus da célula hospedeira.
No entanto, estes determinantes de patogenicidade isolados não são suficientes para explicar a patogenicidade do vírus da gripe (26). Todas as experiências de recombinação realizadas, asseguram que a patogenicidade não depende de um só gene, mas sim na combinação dos genes presentes nos oito segmentos genómicos. No entanto HA e NA têm um papel primordial na infecção (26).
A gripe, causada pelo vírus Influenza é uma doença muito contagiosa, de aparecimento inesperado, habitualmente durante o Inverno e de propagação muito rápida. Em comparação com outras infecções respiratórias, tais como uma constipação comum, a infecção pelo vírus Influenza é muito mais grave.
O vírus da gripe é disseminado de indivíduo em indivíduo através do ar ambiente, pelas gotículas formadas durante o acto de falar, tossir ou espirrar. As partículas do vírus inspiradas pelo nariz ou pela boca, têm uma grande probabilidade de atingirem o tracto respiratório e aí serem depositadas, desencadeando a infecção (figura 13). No entanto o vírus Influenza pode também penetrar no organismo através das membranas mucosas dos olhos nariz ou boca (21). A infecção inicia-se pela fixação do vírus aos receptores mucoproteicos do epitélio respiratório, por onde se difunde continuamente ocasionando um processo inflamatório, com necrose do epitélio ciliado do tracto respiratório superior. Também pode afectar o tracto respiratório inferior (bronquíolos e alvéolos), circunstância que pode produzir sérias complicações bronco-pulmonares.
Figura 13 – Esquema da transmissão e infecção do vírus da gripe. Adaptado de www.infogripe.com/el_mundo_de_la_gripe/index.html
Um indivíduo infectado, pode transmitir a doença a outras pessoas desde 24 a 48h antes do inicio dos sintomas, até cerca do terceiro ou quarto dia da doença.
O período de incubação do vírus da gripe é de 1 a 4 dias, com uma média de dois dias (4). Este período varia de acordo com a quantidade de vírus infectante e com as defesas imunológicas do indivíduo.
Após o período de incubação há um começo abrupto dos sintomas (figura 14). Nos primeiros dias as manifestações sistémicas predominam sobre as respiratórias. O indivíduo afectado apresenta inicialmente sintomas usuais de cefaleia, calafrios e tosse seca. A febre surge logo a seguir, a qual geralmente varia entre os 38 a 40 ºC, porém pode atingir até 41ºC nas crianças. Estas são também muito mais predispostas a sintomas gastrointestinais tais como o vómito e a dor abdominal (15). Também, ocorrem dores no corpo inteiro especialmente nas pernas, braços e região dorsal. Estes sintomas sistémicos mais graves (febre, cansaço, dores de cabeça) diferenciam a gripe de uma constipação comum. A febre possui duração de cerca de três dias , e com a sua redução vão-se tornando mais evidentes os sintomas respiratórios, tais como a secreção nasal, espirros e tosse. Os sintomas respiratórios agudos apresentam duração de cerca de sete dias, porém a tosse e a fraqueza podem persistir até por mais de duas semanas (21).
Figura 14 – Associação gráfica entre o título viral e a gravidade dos sintomas numa infecção pelo vírus da gripe. Neste caso o período de incubação demorou quase dois dias (1,8), e o período de infecciosidade começou a partir do primeiro dia. Adaptado de Oxford J.S., Lambkin R.; Targeting influenza virus neuraminidase – a new strategy for antiviral theraphy
(em www.morirajr.com.br/RBM/rbm899/index.html)
A gripe apresenta também quadros clínicos graves produzidos pelo próprio vírus ou por infecções bacterianas secundárias, já que aquando a infecção pelo vírus as defesas naturais do indivíduo ficam enfraquecidas. Assim pode surgir, por exemplo, pneumonias, encefalias, miopatias, etc.
Em adultos e crianças saudáveis, embora a gripe seja uma doença moderadamente grave, a maioria dos indivíduos recuperam após uma ou duas semanas sem quaisquer efeitos lesivos evidentes. No entanto, esta doença pode causar um impacto muito grave em indivíduos portadores de doenças (como as de foro respiratório, cardíaco, renais, diabetes, anemias, etc) e idosos com mais de 65 anos.
Embora seja muito comum os nossos médicos decidirem que estamos perante uma gripe, o correcto diagnóstico de que o quadro clinico é provocado pelo vírus Influenza só pode ser realizado recorrendo a estudos de laboratório. Estes métodos para detecção de Influenza e do tipo de Influenza, variam na sua sensibilidade, especificidade e complexidade de realização (tabela 2).
Existem diversas metodologias: a detecção da resposta imunológica gerada contra o vírus, a detecção de antigénios virais ou partículas virais e a detecção de ácidos nucleicos de Influenza. Algumas destas metodologias foram adaptadas para obter técnicas de diagnóstico rápido, mas outras permaneceram como técnicas de referencia com fins específicos. Em geral as técnicas de diagnóstico rápido são úteis no atendimento a pacientes e por outro lado, métodos como o cultivo viral e a detecção de ácidos nucleicos encontram-se reservadas para laboratórios envolvidos em programas de vigilância epidemiológica.
Assim, nos centros de atenção a pacientes, é importante dispor de métodos de diagnóstico rápidos, com alta sensibilidade e especificidade (para reduzir os falsos negativos), que não requeiram laboratórios complexos nem pessoal altamente qualificado. Surgem, assim, métodos de imunofluorescência (IF) com uma sensibilidade que oscila entre os 50 a 90% e os testes ELISA com sensibilidade entre 50 a 100% (6). Mais recentemente, a FDA (Food and Drugs Administration) aprovou a utilização de três variantes comerciais de testes que foram desenhados para serem realizados directamente no consultório médico, como é o caso do Directigen Flu A (Becton Dickinson) e do Flu OIA (Biostar) (6).
O cultivo de linhas celulares é a forma mais antiga de detectar a presença do vírus. Possui uma boa sensibilidade (>90%) e especificidade de 100%. É uma técnica muito laboriosa e requer equipamento especial e pessoal treinado. Não permite obter nenhum resultado antes de pelo menos 24 a 48 horas, mas possibilita isolar o vírus. O isolamento deste permite avançar sobre o estudo das suas características e fazer testes a drogas antivirais. Contudo, é uma técnica metodológica indispensável para a obtenção de vacinas que ajudam a prevenir doenças e consequentemente a disseminação.
A técnica de RT-PCR não é suficientemente rápida nem simples de se utilizar rotineiramente, mas a sua vantagem é a sua sensibilidade intrínseca e a possibilidade de diferenciar tipos e subtipos de Influenza directamente sobre a amostra clinica. Esta técnica é também muito vantajosa no contexto dos programas de vigilância pois permite obter informações rápidas sobre a variante viral circulante.
Tabela 2 - Caracterização dos principais métodos usados no diagnóstico do vírus de Influenza. Adaptado de www.funcei.org.ar/veg/diagnostico.htm
Não se recupera a estirpe viral
0,25-2 horas
Temos vírus completo
Laboratório e pessoal especializado
O vírus da gripe está bastante disseminado em todo o mundo, produzindo epidemias anuais com grau variado de gravidade. Só na Europa, EUA e Japão estima-se que anualmente 100 milhões de indivíduos são infectados (21).
Figura 15 – Marcos mais importantes na história epidemiológica do vírus de Influenza. Adaptado de www.micro.msb.le.ac.uk/335/orthomyxoviruses.html
Num ano comum, um em cada dez adultos é portador de Influenza, porém as percentagens anuais de incidência em crianças pode ultrapassar os 30 % (21). A morbidade é concentrada em crianças em idade escolar e em adultos saudáveis, mas as percentagens mais elevadas de mortalidade, decorrentes da infecção pelo vírus da gripe, ocorrem em indivíduos com mais de 65 asnos, sendo relatados 10000 a 40000 mortos somente nos EUA para cada época sazonal (21). A infecção pelo vírus resulta em 25 milhões de consultas médicas anuais, milhões de dias perdidos e centenas de milhares de hospitalizações (17). O impacto económico anual associado à Influenza é estimado em 12 mil milhões de dólares americanos só nos EUA (18).
As pandemias causadas pelo vírus da gripe ocorrem de forma imprevisível como consequência de uma modificação genética maior (shift), aproximadamente em cada 10 a 40 anos, afectando 50% da humanidade (figura 15). A pandemia da "gripe espanhola" (A/H1N1) em 1918, o pior surto de Influenza deste século, levou à morte cerca de 20 milhões de indivíduos em todo o mundo (19). A mortalidade nos EUA associada a cada uma das pandemias recentes de 1957 [A/Ásia (H2N2)] e de 1968 [A/Hong Kong (H3N2)] tem sido estimada como sendo de 100.000 por período pandémico (7). O surto recente da nova estirpe Influenza H5N1 em Hong Kong demonstra a continua ameaça de uma nova pandemia.
Hoje em dia, restam poucas dúvidas que a maioria das pandemias de gripe estão associadas à reassociação genética (shift antigénico) entre estirpes de Influenza A de humanos e de animais de aviários, em animais de aviários (por vezes o porco, mas mais frequentemente aves de capoeira), o qual deriva uma nova estirpe de vírus capaz de infectar humanos para os quais não dispõem de defesas nenhumas. E quando aparece uma nova estirpe de vírus da gripe, somos quase sempre levados a desconfiar da China, apenas por ser a região do mundo onde esses animais são criados em condições de maior promiscuidade e de falta de higiene.
Quando um indivíduo é infectado pelo vírus da gripe, o sistema imunológico responde o mais rapidamente possível de modo a contrariar a sua propagação. Se este indivíduo já contactou com os antigénios do vírus numa primeira infecção ou através da vacinação, a resposta imunológica é muito mais rápida e intensa.
Nos últimos anos, foram realizados avanços importantes na quimioterapia antiviral. O principio básico da intervenção destes medicamentos é a inibição específica do ciclo de vida viral, a qual se traduz directamente numa interrupção da replicação viral e uma consequente redução das partículas infecciosas.
A imunidade adquirida frente a uma infecção pelo vírus da gripe depende fundamentalmente da resposta humoral aos antigénios superficiais do vírus, sobretudo à hemaglutinina.
As mutações que constantemente ocorrem no genoma viral, principalmente nas zonas que correspondem a partes de proteínas que são reconhecidas pelo sistema imunitário, levam à formação de novos subtipos que são pouco ou nada reconhecidos pelo sistema imunitário. Assim, devido à grande variabilidade antigénica, estamos constantemente sujeitos à infecção pelo vírus da gripe, sendo possível até na mesma época sazonal ter mais do que uma infecção.
Desde o final dos anos 40, a vacinação tem sido a melhor forma de prevenir uma infecção pelo vírus Influenza ou diminuir a sua severidade, já que a transmissão é muito difícil de evitar. Além disso, não existem medicamentos eficazes para o combate às infecções. Estes métodos de prevenção são sobretudo recomendados aos grupos de risco anteriormente referidos.
A vacina pode ser preparada com vírus inactivo ou atenuado. Esta última foi utilizada amplamente na antiga União Soviética, mas nunca nos países ocidentais. Um dos métodos de preparação das vacinas com vírus inactivos consiste no cultivo dos vírus em ovos embrionários de galinha. Depois de isolado o vírus é inactivo, e este pode ser usado inteiro ou fraccionado, contendo principalmente as proteínas de superfície.
Em decorrência da variação antigénica do vírus Influenza, as vacinas proporcionam apenas protecção limitada, sendo anualmente necessárias vacinas com novos componentes, bem como a revacinação. A informação obtida a partir das actividades de vigilância regional e internacional auxiliam na monitorização dos tipos de vírus a utilizar nas vacinas a usar em cada época sazonal. Assim, para a época sazonal de 2000/2001 a OMS (Organização Mundial de Saúde) recomenda, para o hemisfério norte, a seguinte composição:
- A/Moscovo/10/99 (H3N2)
- A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1)
Desde o início dos anos 80 existem dois agentes antivirais com actividade contra o vírus Influenza: a amantadina e seu derivado rimantadina (figura 16). Estas drogas inibem a replicação viral por inibição da proteína M2, não ocorrendo, por isso, desempacotamento do vírus. Contudo, estes medicamentos não foram amplamente utilizados pois, para além de só serem activos para o vírus influenza A, houve um rápido aparecimento de resistência por parte do vírus e devido aos seus efeitos colaterais, tanto ao nível do Sistema Nervoso Central como ao nível gastrointestinal (9).
Figura 16 – Fórmulas químicas das primeiras drogas com acção contra o vírus da gripe
A – amantadina; B – rimantadina
Adaptado de www.micro.msb.le.ac.uk/335/orthomyxoviruses.html
Desta forma são desejáveis novas opções terapêuticas ou profiláticas para o controlo da gripe. No entanto, devido à grande variabilidade do vírus da gripe, é difícil arranjar um alvo eficaz e imutável para a acção de novas drogas antivirais.
Figura 17 – Mecanismo de acção dos inibidores da neuraminidase. Os resíduos terminais de ácido siálico permanecem sem sofrer cisão na célula infectada, não havendo assim libertação dos vírus da gripe. Adaptado de Oxford J.S., Lambkin R.; Targeting influenza virus neuraminidase – a new strategy for antiviral theraphy (em www.morirajr.com.br/RBM/rbm899/index.html)
Nos anos 80 descobriram, por cristalografia por raios X e por mutagénese direccionada, que a sequência de aminoácidos e a estrutura tridimensional do local activo da proteína neuraminidase são altamente preservados, embora a restante estrutura seja altamente variável entre todas as estirpes virais de influenza (3). A proteína neuraminidase, tetrâmero em formato de cogumelo, facilita a libertação dos viriões recentemente formados a partir da célula do hospedeiro (figura 17), prevenindo também a sua agregação através da clivagem dos ácidos siálicos terminais do hospedeiro (22). Especificamente, os onze resíduos de aminoácidos que revestem os quatro centros activos de cada neuraminidase e que interagem directamente com o substrato (ácido siálico) encontram-se altamente preservados em todas as estirpes estudadas de influenza A e B. A partir do momento em que foi realizada esta importante descoberta, a inibição da neuraminidase com análogos do ácido siálico tornou-se um conceito atraente para uma intervenção antiviral (figura 17). Estes medicamentos assim direccionados, diferentemente das vacinas que protegem o organismo somente contra algumas estirpes de vírus da gripe, podem demonstrar actividade ampla e persistente contra todas as estirpes clinicamente relevantes. Surgiram, assim, novas drogas como o zanamivir e o GS4071 (figura 18). O zanamivir tem o inconveniente de não ser administrado sob a forma de comprimido, enquanto que o GS4071 o permite. Este último é administrado sob a forma de GS4104 e só no organismo é convertido na forma activa GS4071. Este composto incorpora uma cadeia lateral hidrófoba o que permite uma melhor interacção entre este e a fissura do local activo da neuraminidase, aumentando assim a sua afinidade para o alvo (21). Este composto encaixa-se, assim, na estrutura tridimensional do local activo da neuraminidase interagindo com os resíduos antigenicamente preservados inibindo a enzima competitivamente (figura19).
Figura 18 – Estrutura das novas drogas, zanamivir (B) e GS4071 (C), comparadas com o ácido siálico (A). Adaptado de Laver W.G. et al, Disarming Flu Viruses, Scientific American (em www.sciam.com/1999/0199issue/0199lover.html).
O GS4071 parece ser o grande candidato para resolver o problema do vírus da gripe. No entanto, cientistas já encontraram estirpes de Influenza em laboratório que eram resistentes ao zanamivir e ao GS4071. Apesar disso, estas estirpes apenas tiveram um sucesso limitado. Algumas ficaram resistentes por alteração dos aminoácidos do local activo da neuraminidase, mas estas mudanças diminuíram a sua estabilidade ou a sua actividade, o que prejudicaria a sua sobrevivência no hospedeiro (21). Outras ficaram resistentes por mudanças na hemaglutinina, a qual não precisa da neuraminidase para se libertar do ácido siálico. Mas, por este motivo, a hemaglutinina reduziu a sua afinidade para o ácido siálico, o que reduziu a sua infectividade de estas estirpes por perda de reconhecimento das células hospedeiras (21).
Figura 19 – Estrutura tridimensional da extremidade cefálica da neuraminidase, mostrando o local activo com a molécula de GS4071. Retirada de Oxford J.S., Lambkin R.; Targeting influenza virus neuraminidase – a new strategy for antiviral theraphy (em www.morirajr.com.br/RBM/rbm899/index.html)
Por agora, portanto, o Homem leva vantagem sobre o vírus Influenza, mas este está sempre à espreita de uma oportunidade, não estando fora de questão uma nova pandemia. O Homem vai dando uma ajuda, já que com a aplicação destas drogas permite a selecção de novas estirpes resistentes, tornando mais fácil o aparecimento de outro flagelo.
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