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Antônia Pacheco Alves
1 Métodos imunológicos na avaliação da resposta à vacinação. Patrícia Neves Laboratório de Tecnologia Imunológica VDTEC/Biomanguinhos
2 Proteção vacinal A identificação de marcadores imunológicos que se correlacionem com a proteção contra uma infecção após a vacinação é uma missão importante, pois permite substituir os ensaios de eficácia quando estes não são viáveis ou éticos.
3 Proteção vacinal Correlatos de proteção X Pressupostos de proteção Correlato de proteção (correlate of protection) é uma função imunológica que é responsável pela proteção; Pressuposto de proteção (surrogate of protection) está correlacionado com a resposta protetora, mas não é diretamente responsável pela proteção.
4 Proteção vacinal- Nova terminologia O conceito central é o de que um correlato de proteção reflita uma relação estatística entre um marcador imunológico e a proteção, mas não implica que o marcador seja o agente causador da proteção.
5 Proteção vacinal- Nova terminologia Correlato de proteção Correlato de proteção mecanístico Correlato de proteção Não-mecanístico O correlato de proteção (CoP) pode ser um mecanismo de proteção (MCop), ou um Correlato de proteção não mecanístico (NCoP), que prediz a eficácia da vacina através de sua correlação (parcial) com outra resposta imunológica que protege mecanicamente (Adaptado de Plotkin, 2012).
6 Proteção vacinal- Exemplos A resposta imunológica contra a vacina meningocócica pode ser medida pela detecção de anticorpos por ELISA ou pela detecção de anticorpos bactericidas. Os anticorpos bactericidas são efetivamente responsáveis pela proteção e, portanto, são MCoPs. Os anticorpos medidos por ELISA certamente contém uma fração que não necessariamente são bactericidas, no entanto sua medida também pode ser correlacionada com a proteção, sendo assim é um NCoP.
7 Proteção vacinal- Exemplos Na vacinação contra a Varicella-Zoster tanto a resposta celular quanto os anticorpos medidos após a injeção já foram correlacionados com a proteção. Neste caso, a correlação estatística entre a eficácia da vacina e a resposta celular foi mais forte, e em vista da biologia da doença, a resposta celular seria um MCoP. Os anticorpos, que são de medida mais fácil e precisa, é um NCoP. Neste caso o NCoP é mais útil que o MCoP
8 Proteção vacinal- Exemplos
9 Métodos imunológicos para análise de anticorpos
10 Proteção vacinal- Testes Bactericidas O princípio do ensaio bactericida baseia-se na capacidade dos anticorpos produzidos pela vacinação em ativarem a via clássica do complemento levando à lise da bactéria.
11 Proteção vacinal- Testes Bactericidas Diluições do soro teste (complemento inativado) Bactéria Concentração fixa de proteínas do complemento Diluições que mata 50% ou 90% das bactérias
12 Proteção vacinal- Testes Bactericidas
13 Proteção vacinal- Testes de Neutralização Os testes de neutralização se baseiam na capacidade do anticorpo em se ligarem ao alvo (proteínas do envelope viral ou toxinas), evitando que este se ligue à um substrato celular.
14 Proteção vacinal- Testes de Neutralização Diluições do soro teste (complemento inativado) Partícula viral ou Toxina Substrato celular (Células VERO ou outras) Diluições que diminui a infecção ou efeito citopático em 50% ou 90%
15 Proteção vacinal- Testes de Neutralização
16 Proteção vacinal- Testes de ELISA O ensaio imunoenzimático (ELISA) é um ensaio de ligação antígenoanticorpo, no qual podemos determinar a classe deste anticorpo (IgG, IgM, IgA...); Apesar de ser um ensaio de ligação, o ELISA se mostrou bastante útil na avaliação de respostas vacinais, pois é de fácil execução e bastante reproduzível; O teste também pode ser adaptado para avaliar a avidez dos anticorpos.
18 Métodos imunológicos para análise das funções de células T
19 Proteção vacinal- Função das células T HIV, tuberculose e malária são as três doenças infecciosas com o maior impacto global e vacinas profiláticas são a melhor esperança para seu controle. No entanto, devido à natureza complexa desses patógenos, muitos desafios permanecem para o desenvolvimento destas vacinas.
20 Proteção vacinal- Função das células T Ao contrário das vacinas licenciadas para outros patógenos, para as quais uma resposta humoral é proposta como sendo mediadora chave da eficácia, é provável que exista também a necessidade de uma resposta imunológica celular dominante nesses casos. Por isso, muitas vacinas para estes patógenos mais complexos foram concebidas para induzir ambos os linfócitos T CD4+ e CD8+ específicos. Como conseqüência, os ensaios para quantificar estas células T são necessários para avaliar sua imunogenicidade.
21 Proteção vacinal- ELISpot O ELISpot é um dos métodos mais comumente usados para medir as células T antígeno-específicas; O ELISpot é um método altamente quantitativo, podendo medir um vasto leque de magnitudes de resposta; É capaz de avaliar as atividades celulares relacionadas ao sistema imunológico, como a secreção de IFN-γ e outras citocinas, além da degranulação de granzima B.
22 Proteção vacinal- ELISpot Sendo assim, o ELISpot evoluiu de uma ferramenta de pesquisa para um boa opção como método de avaliação em estudos clínicos de novas vacinas.
23 Proteção vacinal- ELISpot
24 Proteção vacinal- ELISpot
25 Proteção vacinal- Testes de Citometria de Fluxo Embora o ensaio de ELISpot tenha se desenvolvido historicamente como a principal medida da função de células T, este método não permite identificar as células produtoras da citocina e nem permite a medida de múltiplas citocinas na mesma célula; Sendo assim, a citometria de fluxo emergiu como opção importante para avaliar diversos parâmetros como polifuncionalidade das células T, capacidade proliferativa, fenótipo e estado de ativação.
26 CITOMETRIA DE FLUXO Consiste numa técnica em que as células passam diante de um feixe de luz (Laser), uma a uma, através de um fluxo de líquido. Parâmetros mensurados : Tamanho e forma das células Granulosidade Conteúdo de DNA e RNA Atividades enzimáticas Receptores de superfície celular Fluxo de cálcio Açúcares de superfície
27 Componentes Básicos Sistema fluídico Ótico: fonte de luz -Laser(s), Detectores e filtros óticos. Análise de Dados: Computadores Computer System Detector & Mechanical Fluidics
28 FOCO DO LASER CÂMARA DE FLUXO
29 1 RAIO LASER 1 - DISPERSÃO FRONTAL-forward scatter-fcsrefletem o tamanho celular 2 - DISPERSÃO LATERAL -side scatter -SSCrefletem a granulosidade /complexidade citoplasmática da célula. 3 - FLUORESCÊNCIA (CORES) 2 3 granulócitos monócitos linfócitos Side scatter (granularity)
30 ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL LASER ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL
31 VOLUME (FS) DISPERSÃO BLASTOS POLIMORFONUCLEARES MONÓCITOS LINFÓCITOS DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS
32 Freq Detectores de fluorescência FALS Sensor Fluorescence Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
33 Relative Intensity Marcadores fluorescentes Excitation Emission Wavelength 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluoresceína (FITC)
34 Diferentes espectros dos marcadores fluorescentes
35 ESQUEMA ÓPTICO DO CITÔMETRO DE FLUXO FOTOMULTIPLICADOR 4 PMT - 4 FOTOMULTIPLICADOR 3 PMT - 3 FOTOMULTIPLICADOR 2 PMT - 2 FOTOMULTIPLICADOR 1 PMT - 1 FOTOMULTIPLICADOR DE DISPERSÃO LATERAL (PMT - SIDE SCATTER) FILTRO DE BARREIRA CÂMARA DE FLUXO
36 Marcação das células Marcação Direta Antígeno Anticorpo Marcado
37 Marcação das células Marcação Intracelular citocinas enzimas adesão Receptores Permeabilização das células - uso de detergentes