Somatic embryogenesis from immature embryos in maize genotypes
Eloise Helena FernandesI; Alberto José PrioliI; Carlos Alberto ScapimI, 1; Ivan SchusterII; Elisa Serra Negra VieiraII; Antônio Teixeira do Amaral JúniorIII; Lia Mara MoterleI
IDepartamento de Agronomia, Universidade Estadual de Maringá (UEM), 87020-900, Maringá, PR, Brasil. E-mail: cascapim@uem.br
IICooperativa Central de Pesquisa Agrícola (COODETEC), Cascavel, PR, Brasil
IIICentro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual Norte Fluminense (UENF), Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil. E-mail: amaraljr@uenf.br
Palavras-chave: Zea mays, cultura de tecidos, regeneração.
Key words: Zea mays, tissue culture, regeneration.
No Brasil, o milho é cultivado em todo o território. Ao lado da soja, é uma das culturas mais importantes da agricultura brasileira e uma das responsáveis pelo rápido crescimento na produção brasileira de grãos. A produção da safra brasileira em 2004/2005 foi em torno de 35,0 milhões de toneladas, com produtividade de 2.867kg ha-1 em 12,2 milhões de hectares de área plantada (CONAB, 2005). A produção nacional de milho não é suficiente para atender as demandas do mercado interno, gerando problemas de abastecimento para a indústria nacional. A solução para esse problema seria a expansão da área plantada e o aumento da produtividade das áreas atualmente cultivadas.
A engenharia genética, por meio do processo de transformação de plantas, pode possibilitar a obtenção de genótipos mais produtivos e adaptados aos diversos sistemas de cultivo. De acordo com CARNEIRO et al. (2000), o milho transgênico traz incremento médio de 8% na produtividade e esse aumento está relacionado a eventos que contribuem com o aumento da resistência a insetos, a herbicidas e às condições adversas. Diferentes metodologias de transformação genética de plantas foram estabelecidas recentemente, com o desenvolvimento de técnicas de cultura de tecidos e da engenharia genética (BRASILEIRO & CARNEIRO, 1998). Entre elas, pode-se citar: transformação indireta via Agrobacterium tumefaciens, eletroporação, biobalística, microinjeção, entre outras. Para que um programa de transformação de plantas seja eficiente, é necessário que haja uma forma adequada de introdução do gene na espécie e posterior regeneração das células transformadas até a obtenção de uma planta completa. O desenvolvimento da metodologia de propagação e cultura de tecidos via embriogênese somática ou organogênese é estratégia adequada para o estabelecimento de um protocolo eficiente de transformação genética (MILACH et al., 1991).
Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar linhagens ou híbridos elite de milho que apresentem maior capacidade de produção de embriões somáticos e maior capacidade de regeneração de plantas a partir da embriogênese somática.
Foram utilizados 11 genótipos de milho (linhagens/híbridos) dos programas de melhoramento da Universidade Estadual de Maringá (UEM) e da Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola (COODETEC), Paraná (PR). Os genótipos testados foram: um híbrido simples (CD307), um híbrido duplo (CD308), dois híbridos triplos (CD304 e CD306) e sete linhagens elite (GU04328-Maringá, OC-705, 105-B, LD82025, CML314, 202-C e XE23041-B). As sementes dos híbridos e das linhagens foram cultivadas em casa de vegetação (28°C±5°C com fotoperíodo natural de 14 horas luz). Foram usados três vasos para cada genótipo, com duas plantas por vaso, com o objetivo de obter os embriões imaturos necessários para a instalação do ensaio. Todas as plantas foram autopolinizadas e entre 14 e 18 dias após a autopolinização (dependendo do ciclo do material) as espigas foram colhidas para a retirada dos embriões imaturos. Nesta fase, os grãos apresentavam-se no estado leitoso.
O experimento foi inteiramente ao acaso, com número diferente de repetições. Cada repetição foi constituída por uma placa com 10 embriões. O número de repetições variou de três a oito, em função do número de embriões padrão resgatados com menos de 2mm de comprimento. As espigas utilizadas para a dissecação dos embriões imaturos foram inicialmente desinfetadas sem palha em uma solução 1:1 de hipoclorito de sódio (2,5%) e água com duas gotas por litro de Tween 20, em seguida, foram lavadas duas vezes em água destilada autoclavada.
Para a retirada dos embriões do interior dos grãos, realizou-se um corte longitudinal no topo dos grãos, sendo então retirados com o auxílio de agulhas histológicas esterilizadas e incubados em meio N6 (CHU et al., 1975) suplementado com L-prolina (690mg L-1), 2,4-D (10µM), sacarose (20g L-1) e Phytagel (3g L-1). As culturas foram mantidas em salas de crescimento (25°C ±1°C) no escuro, em todos os estágios, e foram subcultivadas a cada 15 dias sempre no mesmo meio.
A regeneração de plantas foi realizada 120 dias após o início da cultura pela transferência de 12 calos por genótipo para placas contendo meio N6 (na ausência de L-prolina e de 2,4-D) na presença de luz, com fotoperíodo de 16 horas luz e intensidade luminosa de 7µ Em-2 s-1. Nesta etapa foram selecionados apenas os genótipos que apresentaram calos embriogênicos. A distinção entre calos embriogênicos e não-embriogênicos foi feita visualmente, considerando os calos friáveis como embriogênicos. Quando esses calos começaram a emitir pontos verdes, foram cuidadosamente repicados e transferidos para caixas magenta contendo meio N6 à metade da concentração dos sais (1/2 N6). Quando as plântulas começaram a emitir raízes, foram trasferidas para bandejas com substrato orgânico e vermiculita e acondicionadas em casa de vegetação. As condições de cultivo foram de 28°C±5°C e fotoperíodo natural, com 14 horas luz.
A análise dos dados foi feita por meio da estatística não-paramétrica aplicando-se o teste de Kruskal-Wallis, a 10% de probabilidade de erro, e as comparações múltiplas envolvendo todos os pares de genótipos.
Nos genótipos LD82025, CML314 e CD308, foi registrada a formação de pró-embriões sobre a superfície dos calos duas semanas após a inoculação. Os genótipos CD307, CD304, OC-705, 105-B e GU04328 geraram calo de aparência compacta e não-embriogênicos. Calos com consistência aquosa foram observados nos genótipos CD306, 202-C e XE23041-B. Os calos friáveis e embriogênicos foram produzidos pelos genótipos CD308, CML314 e LD82025. Estes mantiveram a capacidade de proliferação até o oitavo subcultivo. Os calos dos genótipos CD304 e 105-B não proliferaram no segundo subcultivo, enquanto que os calos da linhagem GU04328 proliferaram apenas até o segundo subcultivo. Da mesma forma, os genótipos CD307 e OC-705 produziram calos que suportaram somente até o terceiro subcultivo. O genótipo LD82025 foi o que apresentou o maior número de calos e também o maior número de plantas formadas (Tabela 1). Por meio dos resultados obtidos, é possível afirmar a influência do genótipo na regeneração de plantas de milho a partir da embriogênese somática.
Os genótipos CD304, 105-B, CD307 e OC-705 se mostraram promissores nos primeiros subcultivos, mas sofreram redução na capacidade de indução de calos embriogênicos nos subcultivos seguintes. SMITH & STREET (1974) afirmam que esse comportamento é comum e que, após um período prolongado de cultivo, o potencial embriogênico do calo declina e esse fenômeno pode variar de acordo com o genótipo, visto que alguns materiais suportam quantidades maiores ou menores de subcultivos. Essa correlaçao entre genótipo e resposta embriogênica em cultura de calos iniciadas a partir de embriões imaturos tem sido bem documentada por vários autores (GREEN & PHILLIPS, 1975; TOMES & SMITH, 1985). De acordo com OZGEM et al. (1996) e MACHII et al. (1998), o genótipo da planta doadora do embrião parece ser fundamental para o sucesso na obtenção de calos embriogênicos.
Na tabela 1 verifica-se que para os três genótipos o número de pontos verdes foi mais alto do que o número de plântulas transferidas tanto para caixa magenta quanto para vermiculita. Esse fato, provavelmente, pode ter ocorrido devido ao processo de aclimatização. Segundo SANTOS-SEREJO & AGUIAR-PERECIN (2000), a aclimatização é etapa de grande influência no processo de regeneração de plantas, sendo que o grau de umidade, temperatura, época do ano e intensidade de luz são pontos que ainda devem ser otimizados para obtenção de maior rendimento de regenerantes. Poucos genótipos de milho são capazes de formar calos tipo II (embriogênico), o que sugere a ocorrência de controle genético na determinação do tipo de resposta ao cultivo in vitro (TOMES & SMITH 1985). Entretanto, na literatura existem poucos relatos sobre os genes envolvidos na embriogênese somática e na regeneração de plantas de milho. Alguns autores demonstram que períodos de estresse durante o cultivo in vitro podem promover aumento nas taxas de indução, maturação e germinação de embriões somáticos (LEE et al., 2001; DRONNE et al.,1997).
Cada um dos genótipos avaliados deve necessitar de uma condição de cultivo diferente para indução de calos e regeneração de plantas. Isso significa que maiores investimentos para otimização das condições de cultivo para cada genótipo seriam de fundamental importância. A obtenção de um número grande de genótipos que apresentem boas respostas regenerativas proporcionaria oportunidade maior para escolha do genótipo mais responsivo a tal característica. Houve diferença entre os genótipos avaliados quanto à capacidade de embriogênese somática e à regeneração de plantas in vitro a partir de embriões imaturos de milho. Essa diferença indica que o genótipo está relacionado com o sucesso de indução de calos embriogênicos e de regeneração. Para a indução de calo embriogênico e regeneração, a linhagem LD82025 foi a mais promissora para utilização em programas envolvendo transformação genética de plantas.
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