Fique Por Dentro - PCR: um exame confiável!?
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A Reação em Cadeia de Polimerase consiste na amplificação de um segmento específico de DNA dentro de um genoma. A tecnologia de PCR em Tempo Real (qPCR/PCR-rt) é uma evolução do método de PCR e seu princípio se baseia na duplicação de cadeias de DNA in vitro que pode ser repetida diversas vezes, gerando quantidade de DNA suficiente para realizar diversas análises. Com apenas um único fragmento de DNA é possível reproduzir milhões de cópias. A sigla qPCR significa PCR quantitativa em Tempo Real, traduzido do inglês Real Time quantitative PCR ou ainda RT-qPCR. Isto porque a metodologia permite realizar a quantificação do alvo durante o processo de amplificação do DNA.
Como método diagnóstico, é amplamente utilizado na infectologia clínica para a detecção de patógenos, identificando infecções em que a cultura dos agentes causadores pode ser muito difícil ou até mesmo impossível. Os ensaios detectam as sequências de ácidos nucleicos dos patógenos.
Os ensaios de PCR em Tempo Real são muito mais sensíveis, específicos e rápidos, principalmente quando comparados aos testes convencionais, levando de duas a três horas para emitir o resultado.
Na qPCR, o resultado é visualizado imediatamente, dispensando a eletroforese. Isto é possível pela adição de sondas fluorescentes às reações de PCR. A amplificação do DNA-alvo é monitorada durante o processo. Conforme o DNA é amplificado, o nível de fluorescência cresce proporcionalmente, e o equipamento é capaz de detectar a fluorescência eventualmente produzida pela amostra. Desta forma, a técnica permite acompanhar a reação e a apresentação dos resultados em tempo real. Ainda, por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original e, por isso, pode ser utilizada para se avaliar a presença de um patógeno em uma amostra de modo qualitativo ou quantitativo.
As vantagens em usar a PCR incluem: trabalha com quantidades mínimas de amostra das quais possa ser extraído o DNA, como sangue, pele, folículos pilosos, esperma, leite, secreções, fezes, tecidos, culturas ou até mesmo fragmentos de fósseis; permite a replicação de grande quantidade de DNA em tempo relativamente curto (aproximadamente duas horas); permite a identificação de diversos agentes patogênicos como bactérias, vírus, fungos, rickétsias, protozoários e mutações genéticas; permite o acompanhamento e avaliação da terapia através da quantificação do agente. Apesar de ser uma técnica muito confiável, contudo, há fatores interferentes que devem ser considerados desde a qualidade da amostra, colheita e acondicionamento, condições durante o transporte e elementos relacionados à realização da técnica.
Em geral, observa-se que a sensibilidade do ensaio de PCR é afetada pelo número absoluto de moléculas de DNA alvo, pelo ambiente complexo das amostras biológicas, pela escassez do agente na amostra e pela complexidade da estrutura de alguns microrganismos, como as micobactérias.
Quanto à amostra é fundamental conhecer a fisiopatologia da doença de modo que sejam obtidas amostras adequadas (sangue, urina, fezes, swabs, etc.) que contenham o agente. Caso a amostra não seja representativa pode-se incorrer em falsos-negativos.
Amostras de sangue hemolisado e de sangue total congelado, além daquelas impropriamente identificadas, devem ser consideradas inaceitáveis para os testes moleculares. O sangue possui elementos que são inibidores da polimerase (taq polimerase) utilizada no método como o heme e a IgG do plasma. Também são inibidores da enzima o EDTA e a heparina presentes em tubos de coleta de sangue, de modo que os anticoagulantes recomendados para essas amostras são os ácidos etilenodiaminotetracético (EDTA) e citrato dextrose (ACD). Ainda, no sangue há grande excesso de DNA genômico que pode interferir na ampliação dos alvos.
O sangue total é estável a temperatura ambiente por 24 horas para análise de DNA e até oito dias, quando resfriado (2-8oC). Para análise de RNA celular, o sangue deve ser coletado com aditivo estabilizador. Coleta e armazenamento de sangue total sem estabilizador não são recomendados para análise de transcrição genética, em função da indução e da degradação de RNA que ocorre in vitro.
No caso do alvo molecular ser um RNA intracelular, é recomendado que o sangue ou a medula óssea seja coletado com um aditivo para estabilização de RNA ou colocado em uma solução estabilizadora de RNA o mais rapidamente possível. Para análises de RNA viral, o sangue deve ser centrifugado e, no caso do tubo sem gel separador, o plasma deve ser removido para outro tubo estéril e livre de RNAses em até quatro horas da coleta. Plasma separado por gel pode ser transportado até o laboratório sem manipulação, sendo esta a preferência de vários serviços para evitar o risco de contaminação. As amostras de plasma são estáveis a 2-8oC por até cinco dias, suportando tempos maiores quando congeladas; recomenda-se que sejam transportadas refrigeradas e congeladas posteriormente, evitando ciclos de congelamento-descongelamento. O soro deve ser mantido congelado e transportado com gelo seco, tanto para as análises de DNA quanto para as de RNA.
Para amostras de medula óssea, deve-se realizar o aspirado utilizando-se uma seringa com EDTA. Para extração de DNA, o aspirado de medula óssea pode ser armazenado temporariamente por até 72 horas a 2-8oC antes do processamento.aso seja necessário armazenar por tempo superior a esse, devem-se remover os eritrócitos e congelar a amostra a -20oC (por até vários meses). Para extração de RNA, o aspirado de medula óssea também deve ser coletado em seringa com EDTA, mas colocado o mais rápido possível em solução estabilizadora de RNA. Quando não for possível, deve ser transportado em meio a gelo triturado, e a extração deve ser realizada em até quatro horas da coleta, caso a amostra não possa ser congelada. A amostra não deve ser congelada antes da eliminação dos eritrócitos.
A extração do DNA é uma das etapas mais fundamentais para o sucesso da prova e deve garantir a ruptura da barreira membrana celular e a recuperação de pequenas quantidades de DNA isentos de contaminantes e inibidores.
Para amostras de tecido, recomenda-se a quantidade de 1 a 2 g, dependendo da celularidade e da quantidade de núcleos da amostra. Por exemplo, pode-se necessitar de menor quantidade de tecidos de linfonodos do que de tecido gorduroso, contudo, qualquer quantidade de tecido (não gorduroso) acima de 10 mg costuma fornecer mais de 10 µg de DNA ou RNA, o que é suficiente para muitas análises diagnósticas.
Para material extraído de blocos de parafina armazenados, os processos envolvidos nas fases de prefixação, fixação, pós-fixação apresentam aspectos que são causa de resultados de produtos finais insatisfatórios. Na fase de prefixação, alterações bioquímicas influenciam na preservação das macromoléculas. As mudanças moleculares causadas pelos fixadores para evitar autólise celular podem ser um limitante no momento da extração de DNA.
Quanto ao desenvolvimento da técnica, o laboratório deve ser confiável, com todas as etapas controladas e voltadas para minimizar as chances de contaminação. Por exemplo, os plásticos para qPCR tem um grande impacto sobre os ensaios em tempo real e precisam receber um tratamento especial para não interferir na reação, principalmente na leitura do sinal fluorescente.
A elevada sensibilidade da técnica de PCR possibilita excelentes resultados, porém também está sujeita a fatores interferentes que podem afetar a sua eficiência e a confiabilidade nos resultados. Referências
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