TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Objetivos: Determinar a susceptibilidade de microrganismos a diferentes antibióticos por meio da técnica de difusão em ágar. Interpretar um antibiograma em função do diâmetro do halo de inibição de diferentes antibióticos.
Princípio: Os antibióticos impregnados nos discos, difundem no ágar e formam um halo de inibição ao seu redor quando encontram bactérias sensíveis. A bactérias resistentes crescem próximo ao disco, não ocorrendo a formação de halo
Material: Placas contendo ágar Mueller-Hinton, Microrganismo isolado em cultura pura (E.coli ou S.aureus) e suspenso em salina (inóculo)
Preparo do inóculo: Tomar 4 a 6 colônias do cultivo puro e inocular em um tubo com caldo BHI. Incubar o tubo por 2 a 5 horas até obter uma suspensão com turvação moderada. O inóculo deve ser adequadamente padronizado, pois caso contrário o resultado do antibiograma poderá ser alterado significativamente. Preparar as diluições de cada cultura em solução salina fisiológica até que a turbidez das suspensões ajustem-se a 108 bactérias/ml. Comparar as suspensões contra um padrão de turvação (0,5ml de BaCl2.2H2O 0,048M em 99,5ml de H2SO4 0,36N) preparado mensalmente.
Semeadura: Utilizar um "swab" estéril para cada cultura, imergindo-o no "inóculo" . Esgotar o excesso de líquido, apertando o "swab" contra a parede do tubo e semear cada microrganismo em ágar Mueller-Hinton em diferentes sentidos, assegurando uma semeadura uniforme.
Aplicação dos discos: Mantendo sempre a assepsia, depositar com uma pinça estéril (imersa no álcool ou flambada na chama) os discos de antibióticos indicados sobre a superfície do inóculo em placa de ágar. Em seguida, com pinça estéril, exercer uma leve pressão sobre cada disco, para se obter uma boa aderência, a fim de permitir um contato do disco com a superfície do ágar. Caso contrário, poderá ocorrer erros na leitura dos resultados, devido a difusão não uniforme do antibiótico no ágar. Não se deve colocar mais de 9 discos por placas de 100mm, assim como, é muito importante levar em conta a distância entre eles.
Incubação: Depois de trinta minutos, as placas devem ser incubadas invertidas a 37ºC durante 16 a 18 horas.
Leitura: Observar e medir o halo de inibição, compararando com a tabela em anexo para determinar a susceptibilidade aos antibióticos: S (Sensível), R (Resistente) e I (Intermediário)
A interpretação dos resultados do antibiograma pelo método dos discos de concentração única é baseada na correlação existente entre os parâmetros seguintes, verificados com relação a diferentes cepas bacterianas:
a) Concentração mínima inibitória (C.M.I.) - dose mínima de antibiótico que, adicionada ao meio de cultura (líquido ou sólido), é capaz de inibir totalmente o crescimento de um inoculum estândar.
b) Zona de inibição ( Z.I.) - diâmetro do halo estéril em torno do disco, em placas semeadas com as mesmas cepas bacterianas.
A observação clínica permitiu estabelecer, ademais, os valores de C.M.I. correspondentes ao sucesso terapêutico, de sorte que é possível inferir, pelo valor de Z.I., qual o antibiótico de escolha para a cepa bacteriana em questão.
Zonas de Inibição (em mm) correspondentes a diferentes graus de Suscetibilidade*
ANTIBIÓTICO OU
Ac . nalidíxico
*R – Resistente; S – Sensível; I – Intermediária
RECOMENDAÇÕES DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLINICA/MEDICINA LABORATORIAL. BOAS PRÁTICAS EM MICROBIOLOGIA CLINICA. SBPC/ML. ED. MANOLE. SÃO PAULO. 2014
A determinação da suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA ou antibiograma) é uma das principais tarefas do laboratório de microbiologia clínica. Em muitas situações, sob o ponto de vista do clínico, os resultados do antibiograma são considerados mais importantes do que a própria identificação do micro-organismo envolvido no processo infeccioso. Em parte, isso pode ser explicado pelo aumento mundial de micro-organismos multirresistentes, o que limita a opção terapêutica. Como consequência, o laboratório dever dar prioridade não só à produção de dados precisos, mas também deve liberar laudos que sejam facilmente interpretáveis.
Os objetivos do teste são detectar possível resistência ao medicamento em patógenos comuns e assegurar a suscetibilidade a drogas de escolha para infecções específicas. Os microbiologistas podem avaliar interações in vitro entre um microrganismo isolado e os agentes antimicrobianos. O antibiograma liberado pode fornecer dados para ajudar o clínico a decidir as drogas de escolha ou, ainda, as doses dos agentes antimicrobianos adequadas ao tratamento da infecção.
Os métodos de análise disponíveis incluem: diluição em caldo, diluição em ágar, difusão em ágar (disco difusão) ou sistemas comerciais automatizados. Os métodos manuais, amplamente difundidos no Brasil, proporcionam flexibilidade, e métodos que geram possíveis reduções de custos incluem a difusão em ágar e métodos de fita com gradiente (E-teste ou M.I.C.Evaluator). Cada método tem pontos fortes e fracos, dependendo, em parte, dos organismos testados. Alguns métodos fornecem resultados quantitativos (concentração) inibitória mínima – CIM), e todos fornecem avaliações qualitativas usando a categoria sensível, intermediário ou resistente.
Discos utilizados no teste:
O método estândar recomendado pela "Food and Drug Administration" dos Estados Unidos utiliza discos de concentração única, que devem ser conservados ao abrigo da umidade (dessecadores) e em temperatura baixa (±3ºC ou - 14ºC, conforme o caso). Utilizam-se discos de concentração única e adequada, para cada antibiótico, à obtenção de halos de inibição indicadores do grau de sensibilidade de diferentes bactérias: penicilina (P), bacitracina (B) – 10UI.; ampicilina (A), colistina (C), estreptomicina (S), gentamicina (G), rifampicina (R), viomicina (VI) - 10 mcg; eritromicina (E), oleandomicina (OL) - 15 mcg; cefalotina (CE), cloranfenicol (CL), declomicina (D), gabromicina (GB), kanamicina (K), a. nalidíxico (NA), neomicina (N), novobiocina (NO), rovamicina (RO), tetraciclina (T), vancomicina (V) - 30 mcg; sulfas em geral, furadantina (F) - 300 mcg, etc.
Multidiscos são oferecidos em numerosas combinações, para atender a diferentes objetivos: infecções urinárias, feridas supuradas, etc.
METODOLOGIAS DISPONÍVEIS PARA A REALIZAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA
Alguns métodos para a realização do antibiograma, convencionais ou automatizados, estão disponíveis para os laboratórios de microbiologia clínica. Esses métodos incluem micro diluição, difusão em ágar, gradiente de antimicrobiano e sistema automatizados. No Brasil, o teste de difusão em ágar continua sendo o mais adotado, por causa da flexibilidade na seleção de drogas, capacidade de responder rapidamente às mudanças de interpretação dos pontos de corte estabelecidos pelo comitês, possibilidade de adição de novos antimicrobianos ao painel do TSA e, principalmente em virtude do baixo custo.
No teste de difusão em ágar, os discos impregnados com concentrações preestabelecidas de antimicrobianos e concentração sérica atingível, são adicionadas a placa de ágar Mueller Hinton. Após o período de incubação, o halo de inibição é medido e categorizado, de acordo com os critérios estabelecidos por documentos padronizados. Diversos documentos para padronização e interpretação do antibiograma estão disponíveis. No Brasil, os mais rotineiramente adotados são Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI (http:clsi.org) e o European Committee on Antimicrobial susceptibility testing – eu cast (http:www.eucast.org).
A metodologia de gradiente (E-teste ou M.IC.Evaluator) apresenta-se como uma alternativa adequada à rotina laboratorial. Consiste em uma fita plástica que, de um lado, está impressa uma escala da CIM, e do outro, existe um gradiente exponencial do antimicrobiano. Essa metodologia não é aprovada pelo CLSI, mas é aceita pela Food and Drug Adminstration (FDA) e pela Sociedade Americana de Microbiologia. Além disso, estudos demonstram que a determinação da CIM pelo método de gradiente apresenta boa concordância com os métodos de referências. Os meios e as etapas de preparação do inóculo e da semeaduras das placas são os mesmos utilizados para a técnicas de difusão em ágar. A categorização da suscetibilidade deve ser realizada de acordo com os mesmos documentos descritos no parágrafo anterior.
Os sistemas automatizados utilizam cartões de plásticos para determinar a CIM. Esse cartões apresentam o antimicrobiano liofilizado e o sistema tem a capacidade de análise computadorizada do crescimento do microrganismo No Brasil, os sistemas mais utilizados para realização do TSA são Vitek, Vitek-2, Walk-away e BD Phoenix. Cabe ressaltar que os sistemas automatizados geralmente avaliam apenas 2 a 4 diluições de cada antimicrobiano, utilizando os pontos de corte específicos para categorização da CIM.
Antibiograma- Métodos Convencionais e MIC
Uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia clínica é avaliar a sensibilidade de microrganismos a antimicrobianos. O objetivo dos testes que fazem esta avaliação é prever, através da realização de provas "in vitro", a probabilidade de sucesso terapêutico no uso das drogas avaliadas no tratamento de infecções causadas pelo microrganismo a ser testado.
O desenvolvimento de novos e variados mecanismos de resistência pelos microrganismos tem gerado o surgimento de um número cada vez maior de antimicrobianos. Esses dois fatores tem levados à necessidade de aprimoramento constante dos testes de sensibilidade a antimicrobianos. Existem varias opções para avaliação de sensibilidade a antimicrobianos, tais como disco-difusão, microdiluição em caldo, métodos rápidos automatizados e, mais recentemente, o E test, que é um teste comercial baseado no método de difusão em ágar.
O método de disco-difusão é o mais utilizado no Brasil e na maioria dos países. Esse teste é realizado através da aplicação de um pequeno disco de papel de filtro impregnado com antimicrobiano a superfície do ágar onde o microrganismo foi inoculado. A difusão do antimicrobiano no ágar levará a formação de um halo de inibição de crescimento. Através da medida do diâmetro desse halo o microrganismo será classificado em resistente (R), intermediário (I) ou sensível (S). É um método bastante simples, fácil de ser realizado e que possui acuracia excelente quando realizado de maneira adequada. Uma desvantagem desse método é o fato dele fornecer apenas um resultado qualitativo (R, I ou S) ao contrário de outros testes que fornecem um resultado quantitativo expresso no valor da concentração inibitória mínima ou MIC. Porém, o conhecimento do MIC será importante para o clínico em algumas situações específicas.
A importância do MIC: O MIC expressa a concentração mínima do antimicrobiano que é necessária para inibir o crescimento do microrganismo que está sendo avaliado. Existem tabelas para a conversão desses valores em R, I ou S, sendo que no Brasil é normalmente utilizada a tabela preparada pelo National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), órgão americano responsável pela padronização de testes laboratoriais. A elaboracão dessas tabelas, levam em consideração não somente a potência "in vitro" do antimicrobiano mas também o nível sérico alcançado pela droga quando a dose preconizada é administrada. Dessa maneira, o conhecimento do MIC pode ser muito útil em algumas situações, como por exemplo infecções em sítios onde o antimicrobiano não apresenta boa penetração ou não se concentra muito bem, tais como meningites e endocardites. Nesses casos será necessário o uso de um antimicrobiano para o qual o microrganismo não só seja sensível mas possua um MIC bem mais baixo que o valor discriminante, isto é, de sensibilidade, ou do valor que separa as amostras sensíveis daquelas intermediárias. Outras situações nas quais o conhecimento do MIC pode ser útil são as infecções urinárias, principalmente aquelas causadas por microrganismos resistentes. Como a maioria dos antimicrobianosa é de excreção renal e alcança altas concentrações na saliva, infecções urinárias baixas podem ser, muitas vezes, tratadas com antimicrobiano para os quais o microrganismo apresente resistência intermediaria ou seja até mesmo resistente, mas apresente MIC próximo ao valor discriminante de resistência.
O conhecimento do MIC pode ser útil também para o acompanhamento de infecções crônicas e/ou de difícil tratamento como osteomielites, por exemplo. Como o tratamento é muito prolongado, pode ocorrer desenvolvimento de resistência, que será detectado somente quando a infecção recidivar, exigindo reinício do tratamento. A detecção de aumento importante do MIC fará com que o clínico ajuste o esquema terapêutico antes que a amostra se torne resistente, não sendo necessário o reinicio do tratamento.
Nos últimos anos tem surgido uma série de aparelhos que realizam antibiograma de maneira automatizada. Esses aparelhos testam vários antimicrobianos simultaneamente e de maneira mais rápida que os métodos convencionais (4-6 horas ao invés de 18-24 horas). Esses métodos utilizam o princípio da microdiluição em caldo, porém poucas diluições de cada antimicrobiano são testadas, de maneira que é fornecido apenas o MIC aproximado. Sua maior vantagem é mesmo a rapidez, caso seja importante o conhecimento do MIC ou Concentração Inibitória Mínima especificando o antibiótico que necessita ser avaliado.
Antibiograma para fungos:
Os testes de sensibilidade a antimicrobianos também tem se tornado importantes para a avaliação de fungos, principalmente leveduras (Candida sp., Cryptococcus neoformans, etc.) Isso se deve tanto ao grande aumento nas opções terapêuticas para o tratamento de infecções fúngicas quanto ao aparecimento e aumento progressivo de cepas resistentes aos antifungicos diponíveis comercialmente. Os mesmos métodos utilizados para a avalização de bactérias têm sido aplicados para a avalição de fungos. Porém, a padronização desses métodos está sendo muito mais difícil devido a grande dificuldade encontrada na realização de estudos clínicos. A resposta clínica parece, em alguns casos, estar mais relacionada ao grau de imunidade do paciente do que a sensibilidade "in vitro" do microrganismo. Isto dificulta muito a definição dos valores limites para classificação da amostra em sensível, intermediaria ou resistente. Na verdade, o NCCLS preconiza que seja liberado apenas o resultado do MIC, que devera ser avaliado e interpretado pelo medico assistente. Alguns métodos, tais como microdiluição em caldo e E test podem ser realizados em laboratórios clínicos e ajudar o clinico na escolha do antifungico mais adequado. Os casos onde a avaliação da sensibilidade parece ter maior utilidade seriam: a) tratamento de infecções sistêmicas por Candida sp.; b) em pacientes graves e/ou imunodeprimidos; c) tratamento de candidíase em pacientes HIV positivo.
Vários estudos têm demonstrado aumento progressivo do MIC ou superinfecção por espécies intrinsecamente mais resistentes nesses casos.
Antibiograma para Micobacterias:
Devido principalmente à AIDS, houve um grande aumento na prevalência de infecções causadas por Micobacterias, principalmente M. tuberculosis e M. avium-intracellulare. Além disso, tem ocorrido grande aumento da prevalência de infecções causadas por cepas resistentes, tornando cada vez mais importante a avaliação da sensibilidade "in vitro" aos antimicrobianos normalmente utilizados no tratamento dessas infecções. Tal avaliação pode ser feita através do método das proporções (manual) ou através do aparelho Bactec 460 (mesmo aparelho utilizado para detecção de crescimento). Devido as dificuldades para a realização do método das proporções, muito trabalhoso, e ao custo dos testes realizados pelo Bactec, poucos laboratorios no Brasil oferecem esse serviço.
Em resumo, a terapêutica antimicrobiana de infecções causadas por algumas bactérias, fungos, vírus e parasitas continua a ser empírica porque ainda não foram detectados problemas de resistência, ou por falta de alternativas terapêuticas. O rápido aumento na prevalência de infecções causadas por microrganismos resistentes, porém, tem exigido não somente o aprimoramento das técnicas laboratoriais como também o maior conhecimento destas por parte do médico assistente. Este deve reconhecer as situações onde os diferentes testes estão indicados e saber interpretar os resultados fornecidos.
QUANDO REALIZAR O ANTIBIOGRAMA?
O laboratório de microbiologia clínica deve realizar o antibiograma somente para micro-organismos patogênicos e que sejam contemplados pelos comitês de padronização (CLSI, Eucast, Anvisa). O TSA não deve ser executado para micro-organismos integrantes da microbiota normal humana (organismos colonizadores) e para micro-organismos cuja sensibilidade aos antimicrobianos seja previsível.
Atualmente, a rotina dos métodos para realização do antibiograma é padronizada para bactérias comuns aeróbias e facultativas, como enterobactérias, Staphylococcus ssp, Pseudomonas ssp, Acinetobacter ssp, Enterococcus ssp, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus do grupo viridans e beta-hemolítico, Haemophilus influenzae, complexo Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis e Vibrio cholerae.
Em algumas situações, como Mycobacterium tuberculosis e fungos invasivos, a realização de antibiograma é importante para o tratamento do doente. Entretanto, este deve ser encaminhado a laboratórios especializados, nos quais os volumes de teste são suficientes para manter a proficiência técnica. Fenótipos de resistência incomum ou resultados imprecisos também devem ser encaminhados aos laboratórios de referência para confirmação.
SELEÇÃO DOS ANTIMICROBIANOS QUE COMPÕEM O ANTIBIOGRAMA
O laboratório tem a responsabilidade de testar os antimicrobianos mais adequados para o microrganismo isolado, o local da infecção e o tipo de paciente atendido. O laboratório que atende pacientes hospitalizados ou imunodeprimidos precisa testar rotineiramente antimicrobianos de maior espectro quando comparados com aqueles que só atendem pacientes ambulatoriais.
A composição do painel de antibióticos a serem testados não é uma decisão exclusiva do laboratório. Embora os comitês padronizadores publiquem uma lista com os antimicrobianos a serem testados diante dos grupos de micro-organismos, é imprescindível que a adequação para cada laboratório seja um consenso entre microbiologistas, corpo clínico, farmácia, comitê terapêutico e comissão de controle de infecção hospitalar.
CUIDADOS COM DISCOS, FITAS DE GRADIENTE E CARTÕES DE SISTEMAS AUTOMATIZADOS.
Os discos devem ser utilizados até a data de validade especificada pelo fabricante e armazenados sob refrigeração ou, ainda, congelados em uma refrigerador frost-free (-20­ *C) até que seja necessário. Discos contendo agente betalactâmico devem sempre ser mantidos congelados, assegurando sua potência, embora uma pequena porção possa ser armazenada sob refrigeração por até uma semana.
Os laboratórios que utilizam equipamentos de distribuição mecânica de discos devem ficar atentos, pois este deve ser mantido tampado hermeticamente e armazenado no refrigerador quando não estiver em uso.
As embalagens com fitas de gradiente devem ser conservadas a -20*C até a data de validade. As fitas de gradiente da embalagem aberta devem ser armazenadas em lugar seco tubo com dessecante a -20 *C. As fitas armazenadas e manuseadas corretamente podem ser usadas até a data de validade. É importante que apenas um único tipo de antibiótico por tubo seja armazenado.
Os cartões (países) de antibiograma dos sistemas automatizados devem ser armazenados sob refrigeração (2 a 8 *C ) e nunca ser congelados. Antes de utilização, checar a validade e realizar inspeção visual do invólucro e do próprio cartão.
Em todos os casos descritos, os antimicrobianos (discos, fitas e cartões) devem ser retirados do freezer ou geladeira 1 a 2 horas antes da utilização. Isso permite o equilíbrio com a temperatura ambiente, minimizando a quantidade de condensação.
PREPARO E ARMAZENAMENTO DO MEIO ÁGAR MUELLER HINTON
O meio ágar Mueller Hinton é o mais comumente utilizado nos laboratórios clínicos, além de ser recomendado pelo CLSI e Eucast. Um rigoroso controle de qualidade é importante para o antibiograma por causa das variáveis. O microbiologista deve ficar atento para algumas características do meio, como o pH, que deve estar entre 7,2 e 7,4 e pode ser medido logo após o preparo do meio. A espessura do meio de cultura distribuído em placas de Petri deve ser de aproximadamente 4mm, garantindo a perfeita difusão do antimicrobiano.
O meio Mueller Hinton deve permanecer sob refrigeração por tempo inferior a 2 meses, desde que protegido da desidratação (embalagem plástica). Antes de semeadura com a suspensão padronizada com o micro-organismo-teste, a placa deve ser deixada em estufa para evaporação do excesso de umidade da superfície do meio.
PREPARAÇÃO DA SUSPENSÃO BACTERIANA
A suspensão bacteriana deve ser preparada com colônias morfologicamente semelhantes, evitando contaminação e dúvida na interpretação dos resultados. A densidade da suspensão deve ser comparada visualmente com um padrão de turbidez 0,5 da escala de McFarland. A suspensão contendo o micro-organismo a ser testado deve ser semeada em ágar Mueller Hinton em no máximo 15 minutos, evitando a mudança no padrão de turbidez.
A preparação das suspensões bacteriana a serem introduzidas nos cartões de antibiograma dos sistemas automatizados também deve ser padronizada de acordo com as recomendações de cada fabricante.
CUIDADOS NA EXECUÇÃO DO ANTIBIOGRAMA
Em até 15 minutos após a semeadura das placas com as suspensões padronizadas de bactérias, os antimicrobianos selecionados devem ser aplicados de forma uniforme a superfície, com pelo menos 24 mm (centro a centro) entre eles. Não devem ser colocados mais do que 12 discos para uma placa de 150 mm de diâmetro e não mais de 5 discos sobre uma placa de 100 mm de diâmetro para evitar sobreposição de zonas.
Muitos antimicrobianos difundem-se no meio quase que imediatamente, portanto, uma vez que um disco ou fita tenha contato com a superfície do ágar, eles não devem ser movidos.
Após a aplicação dos discos ou fitas de gradiente na placa, elas devem ser levadas à estufa em até 15 minutos. Atraso na incubação permite excesso pré-difusão dos agentes antimicrobianos. A incubação se dá a 35 +- 1 * C por 16 a 20 horas, tempo variável de acordo com o agente antimicrobiano testado, conforme indicado no Manuel dos comitês utilizados. Alguns micro-organismos testados em meios suplementados necessitam de uma atmosfera com 5+- 1% de CO²-.
A organização das placas de antibiograma na estufa não deve formar pilhas grandes, garantindo uma temperatura uniforme e rápida em todas as placas.
VALIDAÇÃO DO ANTIBIOGRAMA
Cepas-controle devem ser utilizadas para monitorar o desempenho dos processos. Para os agentes antimicrobianos que fazem parte da rotina, testes de controle devem ser realizados diariamente. Além disso, testes de controle de qualidade devem ser executados a cada novo lote de ágar Mueller Hinton incluído na rotina laboratorial. Para o controle, devem ser utilizados cepas padrão de coleções como American Type Culture Collection (ATCC). A identificação dos micro-organismos (cepa padrão) utilizados para o controle de qualidade é disponibilizada pelos comitês internacionais (CLSI), Eucast, entre outros).
É muito importante que as cepas de referência sejam obtidas a partir de uma fonte confiável, e o armazenamento deve ser mantido de modo que a viabilidade seja assegurada.
LIBERAÇÃO DO RESULTADO
O laboratório de microbiologia clínica precisa estabelecer um sistema documentado de revisão dos resultados. Esse sistema documentado serve para detectar e corrigir erros significativos de transcrição que poderiam afetar a escolha do antimicrobiano para o tratamento de uma infecção. Uma possibilidade é a revisão e conferência dos laudos liberados por uma profissional de alta qualificação, antes da liberação final do resultado. Esse método se tornou um elemento muito importante na rotina laboratorial, já que, em muitos laboratórios, os resultados são interfaceados.
A análise de resultados deve ser feita de forma criteriosa, especialmente se tratando de fenótipos raros de resistência e nos casos de resistência intrínseca a antimicrobianos observados em alguns organismos. Documentos padronizadores, como Eucast e CLSI, publicam uma tabela com o perfil de resistência intrínseca dos principais micro-organismos de interesse médico.
Os sistemas de informática podem dispor de alertas, na etapa de digitação, para resultados improváveis ou absurdos. Esse sistema de vigilância é observado na análise do antibiograma pelos softwares dos equipamentos automatizados. É interessante que resultados críticos sejam estabelecidos documentalmente e, assim que possível, sejam liberados para o clínico solicitante.
O laboratório deve ter política e instruções escritas para a emissão de laudos que contemplem as situações de rotina, os plantões e as urgências. Assim que possível, o antibiograma deve ser liberado para o clínico, podendo ser uma comunicação verbal ou mesmo laudos provisórios. Essas atividades devem ser registradas, incluindo a data e o horário da notificação, o responsável pela comunicação e a pessoa notificada.