Avaliação histológica qualitativa dos efeitos do Sunitinib no tratamento de tumores induzidos em bolsa jugal de hamster sírio dourado - PDF
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Ana Júlia Dinis Borba
1 Avaliação histológica qualitativa dos efeitos do Sunitinib no tratamento de tumores induzidos em bolsa jugal de hamster sírio dourado Mariana Oliveira de Oliveira 1, Maria Antonieta Lopes de Souza 1 (orientador) 1 Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, FaBio, PUCRS Resumo Introdução As neoplasias malignas da cavidade bucal representam cerca de 3 a 5% de todas as neoplasias malignas. O carcinoma espinocelular é o mais freqüente, representando cerca de 90% dos tumores malignos da cavidade bucal. Sua causa é desconhecida, porém vários fatores predisponentes têm sido indicados, sendo os mais importantes o uso de tabaco, álcool, cirrose hepática, exposição solar, deficiências nutricionais, agressões dentárias crônicas, higiene bucal precária, infecções virais, entre outras coisas. Ocorre mais freqüentemente em homens do que mulheres (2:1), com idade superior a 40 anos. Atualmente, o câncer é uma das causas mais comuns de morbidade e mortalidade, onde a cada ano, no mundo, surgem 10 milhões de novos casos e 6 milhões de pessoas morrem em decorrência dessa doença. O câncer bucal de células escamosas é o oitavo tipo de câncer mais comum no mundo. Modelos de tumores animais que imitam muito proximamente o câncer bucal humano são importantes para elucidar os mecanismos da transformação neoplásica além de guiar a prevenção química efetiva. O câncer bucal de células escamosas pode ser induzido em hamsters, e esse é um dos sistemas mais utilizados para analisar o desenvolvimento de câncer oral de células escamosas. O Malato de Sunitinib (Sutent ) é um antiangiogênico e antitumoral, de uso oral. Sendo utilizado em humanos, principalmente em casos de câncer renal, está ligado ao crescimento e formação de metástases. Também tem mostrado atividade antitumoral potente em modelos animais. 93
2 Estudos de farmacocinética mostram que o Sunitinib, sendo de uso oral, é bem absorvido e a sua biodisponibilidade não é afetada pela alimentação. Os níveis plasmáticos de Sunitinib atingem o seu pico entre 6 e 12 horas após dose única via oral, e a farmacocinética é linear em doses de 50 a 100mg/dia (Sakamoto, 2004). Em estudos de determinação de planos de tratamento para humanos, ficou sugerida como máxima dose tolerada a dose de 50mg/dia e o cronograma preferido foi de 4/2 (quatro semanas de tratamento e duas de intervalo). O Sunitinib tem sido bem tolerado e tem um perfil consistente e previsível. Os efeitos adversos mais comuns tem sido fadiga, diarréia, náusea, vômito e anorexia. Objetivos Produzir câncer de células escamosas em bolsa jugal de hamster com 55 dias de exposição ao DMBA, seguindo o protocolo de Oliveira (2008). Verificar a ação do Malato de Sunitinib (Sutent ) em câncer bucal de células escamosas induzido em bolsa jugal de hamster sírio dourado. Analisar os aspectos histológicos entre os grupos tratados e não tratados com o fármaco. Materiais e Métodos Este estudo foi realizado no Laboratório de Biologia Celular e Tecidual da Faculdade de Biociências da PUCRS. O presente protocolo de pesquisa foi submetido à análise do Comitê de Ética para o uso de animais (CEUA) da PUCRS e aprovado segundo o protocolo número 10/ Todos os procedimentos envolvendo manuseio, anestesia, analgesia e eutanásia dos animais estão de acordo com as regulamentações do Conselho Federal de Medicina Veterinária e a Lei de 8 de setembro de 2008 sobre uso científico de animais (Lei Arouca). Os hamsters foram mantidos em duplas, em caixas com maravalha autoclavadas três vezes por semana. A manipulação era realizada sempre no mesmo horário, diariamente, a fim de diminuir o estresse dos animais. A entrada de pessoas era restrita aos que realizavam a manipulação e também havia controle de iluminação e temperatura, com a mesma finalidade. Os animais eram alimentados de forma padronizada e recebiam os mesmos objetos para entretenimento. Foram utilizados 44 hamsters sírios dourados, divididos em 6 grupos, conforme descrito na tabela 1. 94
3 Os animais dos grupos 5 e 6, que eram submetidos à indução tumoral, foram expostos ao agente carcinógeno, DMBA (Sigma), 3 vezes por semana. Para tanto, as bolsas jugais do lado direito dos animais eram pinceladas com DMBA 1% diluído em acetona, com pincel de pelo de marta. O peróxido de carbamida (agente clareador dentário) era aplicado nos grupos 3, 4, 5 e 6, duas vezes por semana, com a própria ponta da seringa aplicadora, também apenas na bolsa direita. As bolsas jugais do lado direito dos grupos 2 e 4 eram pinceladas apenas com o veículo do DMBA (acetona), três vezes por semana. O tratamento foi realizado com Malato de Sunitinib (Sutent ), nos animais do grupo 6, com duração de quatros semanas. Divisão dos grupos: Grupos 1 Controle (n=4) 55 dias (Sem manipulação e sem tratamento) 2 Manipulação com aplicação de acetona (n=4) 55 dias (Acetona) 3 Manipulação com aplicação de clareador (n=6) 55 dias (peróxido de carbamida 10%) 4 Manipulação com aplicação de acetona e clareador (n=6) 55 dias (Acetona e Clareador) 5 Indução de câncer com DMBA sem tratamento (n=12) 55 dias (Clareador + Acetona + DMBA) 6 Indução de câncer com DMBA e tratamento (n=12) 55 dias (Clareador + Acetona + DMBA) + 30 dias (Sunitinib) Tabela 1 Até o momento não existem protocolos descritos de utilização de Sunitinib para hamsters, por isso a dose utilizada em nosso trabalho foi de 40mg/kg/dia por animal de acordo com protocolo previamente descrito por Tugues em 2007, para rato, com efeito farmacológico significativo. Durante o tratamento, os animais eram pesados semanalmente e a dose era recalculada a cada modificação da média dos pesos. A diluição do medicamento era realizada no 95
4 momento da gavagem, sendo as cápsulas de 25mg misturadas com água destilada em um agitador magnético e imediatamente utilizada. O tempo de tratamento foi de 4 semanas, de acordo com protocolo semelhante ao utilizado nas fases iniciais do tratamento com humanos. Após os tratamentos, os animais foram eutanasiados com injeção intraperitoneal de 100mg/kg de pentobarbital sódico, sendo submetidos à toracotomia e incisão cirúrgica do ventrículo esquerdo, onde foi colocada uma cânula para perfusão transcardíaca de 150 ml de solução salina, seguida de 150 ml de solução de paraformaldeído 4% e glutaraldeído 0,25% dissolvidos em tampão fosfato 0,1M ph 7,4. As bolsas jugais foram cirurgicamente retiradas, pós fixadas na mesma solução, seccionadas macroscopicamente, medidas e emblocadas em parafina, seccionadas em micrótomo com espessura de 10 micrometros e coradas com hematoxilina e eosina para posterior observação histológica. Resultados Previamente à aprovação do CEUA, foi realizada uma análise histológica de bolsas jugais normais pertencentes ao laminário do Laboratório de Biologia Celular e Tecidual da PUCRS, o que nos serviu de parâmetro para as conclusões observadas nos cortes obtidos a partir de nosso experimento. No estudo histológico prévio foi observado que nas bolsas jugais não expostas ao carcinógeno, o epitélio tem aspecto normal, sem hiperplasias, com suas camadas bem delimitadas e uma discreta camada de queratina. O tecido conjuntivo apresenta se íntegro, sem infiltrado inflamatório e sem hiperplasia vascular. Na verificação das lâminas produzidas pelo nosso experimento, foi possível observar as alterações causadas pela indução tumoral nas lâmias expostas ao carcinógeno (DMBA), quando comparadas aos demais grupos. As células malignas mostram alterações bioquímicas, morfológicas e funcionais variadas que lhes conferem propriedades importantes. Como a taxa de multiplicação das células malignas é elevada (índice mitótico alto), o câncer usualmente tem crescimento rápido. O mesmo não acontece com o estroma e os vasos sanguíneos, que se desenvolvem mais lentamente, resultando em degenerações, necroses, hemorragias e ulcerações freqüentes. Em razão da perda da diferenciação celular, as células malignas apresentam atipias variadas, desde discretas até muito intensas, chamadas de anaplasias. Há também atipias 96
5 arquiteturais ou histológicas, pois as células neoplásicas não se organizam segundo a orientação própria do tecido normal. Os aspectos histológicos verificados na análise histológica produzida por nosso experimento obteve os seguintes resultados: Grupos: 1 Controle; 2 Acetona; 3 Clareador; e 4 Acetona e clareador: Apresentaram o mesmo aspecto microscópico, evidenciando um epitélio estratificado de poucas camadas, com a camada de queratina com aproximadamente a mesma espessura do epitélio. A mesma quantidade de tecido conjuntivo, com a Proporção de 1/3. A camada granulosa do epitélio se apresenta bem nítida. O tecido conjuntivo tem aspecto normal, sem infiltrado linfo plasmocitário e com o número de vasos sanguíneos dentro da normalidade. Abaixo do tecido conjuntivo, verifica se uma camada de tecido muscular estriado esquelético cortada transversalmente, que corre paralelo a extensão da bolsa, só na porção distal da mesma, representando a musculatura distensível da bolsa jugal do hamster. Podem ser observadas células adiposas dispostas normalmente no campo. Grupo 5 DMBA: Epitélio estratificado pavimentoso queratinizado, imagens de células epiteliais com alteração de núcleos, parecendo birrefringentes. Alteração localizada do tecido epitelial, com discreto espessamento. Em algumas regiões, há um adelgaçamento do epitélio, com aspecto similar à quando está prestes a formar uma úlcera. O tecido conjuntivo, em algumas regiões, aparece basófilo e tumefeito, com aspecto parecido com tecido mucoso. Há um maior número de núcleos no tecido conjuntivo e menor número de fibras (edema). Há também, um aumento do número de vasos, com presença de vasos grandes e neoformação vascular. Pode se observar hemorragia em alguns locais, assim como infiltrado linfo plasmocitário. Pode se visualizar degeneração hidrópica pontual no tecido conjuntivo. Grupo 6 DMBA + Sunitinib: Nesse grupo, verificamos a grande maioria dos núcleos em tamanho normal. O epitélio em sua maior extensão apresenta aparência normal, em alguns locais com modificações nos núcleos. Discreto espessamento do epitélio em determinadas regiões. 97
6 Em algumas lãminas é possível visualizar hiperemia, infiltrado linfo plasmocitário, hemorragia, hiperplasia epitelial, aumento do numero de vasos sanguíneos, assim como presença de poucos vasos calibrosos localizados. Discussão Talvez em análise quantitativa, possamos precisar de forma mais correta, a diferenciação entre os tecidos com indução tumoral apenas e os que receberam tratamento com o fármaco apresentado. 98