Determinação de resíduos de avermectinas em fígado bovino por cromatografia líquida de alta eficiência
https://doi.org/10.1590/S0101-20612003000100012
Determination of avermectins residues in bovine liver by high performance liquid chromatography
Scheilla V. C. SouzaI, *; Gilsara SilvaII; Maria Helena G. M. DinizII; Eleonora V. SantosII; Josefa A. Lima II; João C. TeodoroII
IUnidade de Garantia da Qualidade, Laboratório Regional de Apoio Animal (LARA/MG), Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), Tel. (31) 36613000, Fax (31) 36612383, e-mail labmg@yahoo.com.br
IISetor de Cromatografia, Laboratório Regional de Apoio Animal (LARA/MG), Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), Tel. (31) 36613000, Fax (31) 36612383, e-mail labmg@yahoo.com.br
Palavras-chave: abamectin, doramectin, ivermectin, resíduos, fígado, cromatografia líquida de alta eficiência.
A method for determination of abamectin, doramectin and ivermectin residues in bovine liver was standardized and validated using acetonitrile extraction, clean-up with nd C18 cartridges, derivatization, detection and quantification by HPLC/FL. In the assays using spiked samples in levels varying from 5 to 100mg/kg the average recovery values ranged from 69.0 to 101.4% with coefficient of variation values between 5.5 and 28.1%. The limit of detection and quantification of this method, for each studied residue, was 5µg/kg.
Keywords: abamectin, doramectin, ivermectin, residues, liver, high performance liquid chromatography.
Abamectin, doramectin e ivermectin são compostos pertencentes ao grupo das avermectinas, lactonas macrocíclicas, quimicamente relacionadas e naturalmente produzidas a partir do Streptomyces avermectilis [2]. Possuem alta atividade antiparasitária, aliada à dosagens únicas e extremamente baixas [4], administradas via oral ou injetável [5, 20]. Causam a paralisia de nematódeos e artrópodes susceptíveis devido à inibição do neurotransmissor ácido gama-aminobutírico [3].
As avermectinas são drogas utilizadas extensivamente em animais produtores de alimentos, sendo de grande importância a determinação do tempo de retirada destes medicamentos [17] e o monitoramento de seus resíduos em tecidos animais destinados à alimentação humana [18], devido ao risco de efeitos no sistema nervoso central [3, 4]. Os tecidos alvos sugeridos para monitoramentos são fígado, órgão de metabolização destas drogas, e tecido adiposo, devido ao caráter lipofílico das avermectinas [6, 11, 15].
A União Européia determinou limites máximos de 20µg/kg para abamectin e 100µg/kg para doramectin e ivermectin em fígado bovino, e de 10µg/kg para abamectin, 150µg/kg para doramectin e 40µg/kg para ivermectin em tecido adiposo bovino, sendo proibida a utilização de doramectin em bovinos produtores de leite para consumo humano [11]. O CODEX ALIMENTARIUS estipulou um limite máximo de resíduo de 100µg/kg para cada um dos três resíduos em fígado bovino e de 100µg/kg para abamectin, 150µg/kg para doramectin e 40µg/kg para ivermectin em tecido adiposo bovino [7]. Enquanto no Brasil foi estabelecido um limite máximo de resíduo de 100µg/kg para ivermectin em fígado bovino [1].
A confiabilidade dos estudos relativos à presença destes compostos em alimentos de origem animal e outras matrizes é extremamente dependente da eficiência do método analítico empregado [22]. Os primeiros métodos publicados para determinação de avermectinas empregavam purificação por extração em fase sólida e partição líquido:líquido seguidas de determinação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em fase normal, com detecção por ultra-violeta (UV) [16, 21]. Posteriormente, métodos mais rápidos foram desenvolvidos empregando purificação com cartuchos de extração em fase sólida, seguidos de determinação por CLAE/UV em fase reversa [15]. Métodos empregando purificação, seguida de derivatização para um composto fluorescente e posterior determinação por CLAE, detecção de fluorescência (FL) têm sido amplamente utilizados [9, 12, 13, 17, 19, 22, 23] e recomendados por organismos oficiais de regulamentação [1, 7].
O presente trabalho objetivou otimizar e validar um método multiresíduo para determinação das avermectinas abamectin, doramectin e ivermectin em fígado bovino, baseado nos descritos por CRAYG [9] e ROUDAUT [19], para atender as atividades de monitoramento do Laboratório Regional de Apoio Animal (LARA/MG), integrantes do Plano Nacional de Controle de Resíduos Biológicos em Produtos de Origem Animal do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA).
Amostras de fígado bovino, livres dos resíduos pesquisados (abamectin, doramectin e ivermectin), foram utilizadas como amostras brancas, após análise segundo procedimentos do LARA/MG. Estas amostras foram identificadas, homogeneizadas, embaladas em sacos de polietileno e mantidas sob congelamento (-10oC a -17oC) até o momento das análises.
2.2 – Padrões
As soluções dos padrões de abamectin, e ivermectin, ambos da marca Merck Sharp & Dohme (Rahway, NJ) e de doramectin, da marca Pfizer (Nagoya, Japan), foram preparadas em metanol, identificadas, acondicionadas, avaliadas (em termos de intensidade do sinal e tempo de retenção das substâncias pesquisadas) e armazenadas, sob congelamento (-10oC a -17oC), até o momento das análises. As soluções estoque foram preparadas com 10µg/mL de cada substância enquanto a solução para adição às amostras (pool) foi preparada com 500ng/mL de cada substância.
2.3 – Procedimentos analíticos
Os procedimentos analíticos padronizados e validados foram baseados nos descritos por CRAYG [9] e ROUDAUT [19].
2.3.1 – Extração
Após o descongelamento da amostra de fígado bovino, até temperatura suficiente para o corte, foram pesados 5g, acrescentados 15mL de acetonitrila e extraídos os resíduos de abamectin, doramectin e ivermectin por centrifugação durante 10 minutos a 3500rpm, a 25ºC ± 5ºC.
2.3.2 – Purificação
Os extratos, adicionados a 40mL de água e 50µL de trietilamina, foram percolados em cartuchos Waters de C18 6mL/500mg (previamente condicionados com 5mL de acetonitrila e 5mL de acetonitrila:água 30:70, v/v, contendo 0,1% de trietilamina) e posteriormente eluídos com 5mL de acetonitrila.
2.3.3 – Derivatização
Após evaporação do solvente (45ºC) sob fluxo de nitrogênio, a derivatização dos extratos purificados das amostras e das soluções padrões foi realizada por adição de 150µL da mistura derivatizante (200µl de 1-metilimidazol, 600µL de anidrido acético e 900µL de dimetilformamida), seguida de aquecimento por 60 minutos, entre 95ºC e 100ºC, em bloco aquecedor. Após o resfriamento à temperatura ambiente, a derivatização completa foi indicada pela formação de um extrato marrom escuro.
2.3.4 – Separação, detecção e quantificação
Os extratos derivatizados foram posteriormente completados para 1mL com metanol, filtrados em membrana Millipore de 0,45µm e analisados por CLAE (sistema de bomba quaternário, degaseificador de membrana, injetor automático e detector FL Termo Separation Products; aquisição, controle e processamento de dados por microcomputador IBM), sob as seguintes condições:
- detector de fluorescência com comprimentos de onda de excitação e emissão a 364 e 426nm, respectivamente;
- coluna Lichrosorb RP 18, 7µm, 250mm x 4mm e pré-coluna Lichrospher 100 RP 18, 4mm x 4mm;
- fase móvel metanol;
- fluxo de 0,9mL/min;
- tempo de separação de 12 minutos para os três resíduos;
- volume de injeção loop de 20µL;
- integração pelo parâmetro altura.
2.4 – Procedimentos de validação
A validação do método foi conduzida segundo o procedimento de validação intralaboratorial do Setor de Cromatografia do LARA/MG [8, 10, 14].
2.4.1 – Ensaios com padrões
Nos ensaios com soluções padrões (pools) foram avaliados a linearidade sem interferência da matriz e o limite de detecção do equipamento [8, 10, 14]. As soluções utilizadas foram de 0; 12,5; 25; 125; 250 e 500ng/mL.
2.4.2 – Ensaios com amostras adicionadas de solução padrão das substâncias pesquisadas
As amostras (2.1) foram adicionadas de solução padrão, nos níveis de 5; 7; 10; 25; 50 e 100µg/kg, em pelo menos cinco repetições. A cada grupo de amostras foi incluída uma amostra em branco. Também foram realizados ensaios com sete amostras adicionadas de solução padrão, em níveis desconhecidos pelo analista, entre 25 e 100µg/kg.
Nestes ensaios foram avaliados especificidade, exatidão, precisão, limites de detecção e quantificação do método [8, 10, 14].
2.4.3 – Valores de referência
Foram adotados como referência para avaliação da exatidão e precisão os valores estabelecidos como aceitáveis pelo CODEX [8] e internalizadas pelo MERCOSUL [14] para métodos quantitativos (Tabela 1).
Nos ensaios com soluções padrões (0; 12,5; 25; 125; 250 e 500ng/mL) somente não foram detectados abamectin, doramectin e ivermectin na solução de 12,5ng/mL. Para as demais soluções picos dos três compostos foram registrados, com sinais três vezes maior que o valor do maior sinal de ruído nos cromatogramas. Desta forma, foi demonstrada linearidade da resposta, com coeficientes de determinação superiores a 0,995, na faixa de 25 a 500ng/mL.
O limite de detecção do equipamento, determinado como a menor massa da substância detectada, nas condições estabelecidas pelo método, com sinal, no mínimo, três vezes o valor do maior sinal de ruído no cromatograma [8, 10, 14], foi de 0,5ng, para cada um dos três resíduos, correspondente à massa injetada em 20µL da solução de 25ng/mL.
Especificidade foi observada nos ensaios utilizando amostras adicionadas de solução padrão. Os picos de abamectim, doramectim e ivermectim apresentaram resolução satisfatória, separados dos picos de interferentes. Houve concordância entre os tempos de retenção e intensidade de resposta dos três compostos pesquisados quando comparados os cromatogramas obtidos para soluções padrões e para as amostras (Figura 1).
Os valores médios de porcentagem de recuperação variaram entre 92,9 e 101,4% para abamectin; 91,5 e 99,5% para doramectin e 69,0 e 98,4% para ivermectin. Os coeficientes de variação apresentaram-se entre 6,1 e 23,9% para abamectin; 5,9 e 26,8% para doramectin e 5,5 e 28,1% para ivermectin (Tabela 2). Como os valores de porcentagem de recuperação médios e coeficiente de variação apresentaram-se dentro dos intervalos descritos como aceitáveis (Tabela 1) [8, 14] para todas as concentrações avaliadas, foi determinado como limite de detecção e quantificação do método o menor nível estudado (5µg/kg). Avaliando-se os resultados individuais de porcentagem de recuperação (Figura 2), observa-se uma maior dispersão dos resultados, quanto menor a concentração dos analitos na matriz.
Nos ensaios com amostras adicionadas de solução padrão, em concentração desconhecida pelo analista, os resultados médios de porcentagem de recuperação foram 101,1; 101,0 e 96,7%, com coeficientes de variação de 11,2; 9,2 e 12,5% para abamectin, doramectin e ivermectin, respectivamente. Na Figura 3 pode ser observada a dispersão dos valores de porcentagem de recuperação obtidos para estas amostras de concentração desconhecida, os quais variaram entre 82,0 e 117,0%.
Peso da amostra, volume final do extrato, temperaturas do banho de água e do bloco aquecedor, etapas de evaporação dos extratos e etapa de derivatização, foram considerados pontos críticos de controle do método em observações durante os procedimentos de validação.
O método otimizado e validado mostrou-se eficiente em termos de linearidade, especificidade, exatidão e precisão, além de possuir limite de detecção e quantificação suficientemente baixo, para ser adotado nas atividades de monitoramento de resíduos de avermectinas em fígado bovino do MAPA.
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