Monografia apresentada ao Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Agradeço meu orientador Miguel, por todas as oportunidades e por estar sempre presente. A todos os amigos do Laboratório de Biodados, Biologia Celular e Desenvolvimento, Flávia e Viviane pela ajuda nos experimentos e por tornarem o trabalho muito mais agradável. à minha família e amigos pelo apoio. Às meninas do EMAC, pois o simples fato do grupo existir já é divertido. Aos amigos canadenses, Dan Gietz e Cheryl St. Laurent, por tornarem este trabalho possível.
5.1.3-Triagem em placas de meio sólido............................................................... 31
O sistema de duplo-híbrido consiste em um método genético que seleciona produtos de cDNA presa que interagem com uma proteína isca de interesse. Aqui reportamos dois protocolos de triagem líquida que melhoram este método valioso e eliminam o a trabalhosa triagem clássica em placas de meio sólido. Para avaliar a eficácia da triagem líquida, usamos a linhagem de S. cerevisiae KGY37, três iscas diferentes: h-TRIM32, m-Rtel1 ou m-Trim2 e as respectivas bibliotecas de cDNA: músculo esquelético humano, testículo de camundongo e cérebro de camundongo. A linhagem de levedura Y190 também foi utilizada para uma triagem com a isca Trim2. Estas combinações tinham sido previamente triadas com o método clássico, permitindo uma comparação direta com método novo. Cada triagem consistiu em 120 receitas de transformação (LiAc/PEG/ssDNA) resultando em 40 milhões de transformantes (ensaio com TRIM32) e duas abordagens foram utilizadas: (i) na primeira, 60 transformações foram divididas em 10 frascos de cultura com meio SD-W-L-H +Amp +3AT (0,5 mM para KGY37 e 2,5 mM para Y190); (ii) na segunda abordagem, 60 transformações foram divididas em quatro placas 96-deepwell. As culturas foram incubadas a 30ºC e diluídas de acordo com testes anteriores, resultando em crescimento das culturas na presença de interação entre as proteínas. Em todas as triagens as culturas crescidas foram plaqueadas e estes positivos iniciais foram analisados para confirmar as interações. Verificamos a ativação do gene repórter LacZ, a maioria dos clones eram positivos e foram depois validados e seqüenciados. Concluímos que a quantidade de interações obtidas na triagem líquida é comparável ao método clássico e o meio líquido é uma alternativa mais fácil, econômica e eficiente para ensaios de duplo-híbrido.