Laboratório de Diagnósticos | Prevet - Sanidade Aquícola
Microbiologia e Identificação Molecular
O objetivo da necropsia é determinar a causa da queda de desempenho, mortalidade ou lesões em determinado lote de peixes, através da análise de tecidos e órgãos.
A necropsia é uma ferramenta auxiliar no diagnóstico, que pode ser utilizada para confirmar, refutar, esclarecer, modificar ou estabelecer o diagnóstico. Durante a necropsia é possível colher o material necessário para análises microbiológicas, sorológicas e histopatológicas.
Muitos erros de diagnóstico podem ser evitados ou corrigidos pela realização da necropsia por um profissional experiente.
O setor de Microbiologia da PREVET trabalha constantemente no isolamento e na identificação de bactérias causadoras de surtos em pisciculturas de todo território nacional. Além disso, a PREVET conta com moderna infraestrutura que permite a preservação dos isolados por longos períodos, o que têm possibilitado a execução de estudos científicos mais aprofundados para o desenvolvimento de soluções que se encaixam perfeitamente às necessidades de nossos clientes.
O objetivo do diagnóstico microbiológico associado à identificação molecular é determinar com exatidão a espécie bacteriana causadora do surto em uma dada população de peixes e de preservá-la para a posteridade.
É coletado um fragmento do órgão ou tecido acometido, o qual é inoculado em uma placa de petri contendo o meio de cultivo (placa de isolamento primário) e mantida em condições de temperatura e umidade adequadas para a multiplicação das bactérias. A obtenção da colônia bacteriana viabiliza a execução do teste de Gram que permite classificar a colônia quanto á sua morfologia, a reação de PCR e o sequenciamento do gene 16S bacteriano para a identificação do agente causador da doença, e finalmente a semeadura e a multiplicação da colônia em caldo específico para sua posterior preservação em nitrogênio líquido.
Após o isolamento bacteriano realiza-se o diagnóstico molecular, o qual é constituído de três etapas. Inicialmente, realiza-se uma PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com o DNA extraído da bactéria isolada e oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene da subunidade 16S do DNA ribossomal (16S DNAr). Em seguida, o produto da PCR é encaminhado para o Centro de Recursos Biológicos e Biologia Genômica – CREBIO (UNESP de Jaboticabal-SP) para a realização do sequenciamento com a enzima AmpliTaq polimerase e BigDye Terminator (Applied Biosystems). Finalmente, a sequência obtida no sequenciamento é comparada com o banco de dados do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) através da ferramenta BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Admite-se concordância de no mínimo 95% para confirmação da especificidade da sequência.
O antibiograma é um exame laboratorial que avalia a sensibilidade de uma linhagem bacteriana isolada para diferentes antibióticos. É, por definição, um teste de sensibilidade in vitro.
Na prática, o antibiograma é utilizado para se saber qual antibiótico é o mais indicado em determinado surto dentre os disponíveis no mercado com utilização autorizada para peixes pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Desta forma, além de se evitar a propagação da resistência bacteriana no meio ambiente, prescreve se a droga mais eficiente para um dado surto.
O antibiograma é uma ferramenta importante que deve ser utilizada para o uso mais racional dos antibióticos que garante melhor eficiência terapêutica e sustentabilidade.
A análise de parasitas nas pisciculturas é feita através de uma Necropsia Parasitológica, durante a qual são observadas estruturas externas, como olhos, boca, narina, pele e brânquias, e internas, como estômago, intestino e bexiga natatória do peixe. Os parasitas colhidos são então observados ao estereomicroscópio para poderem ser identificados. Os parasitas encontrados no exterior do peixe são chamados ectoparasitas e os no interior são endoparasitas.
O objetivo das análises parasitológicas é identificar e diagnosticar enfermidades parasitárias que possam estar levando a perdas econômicas na produção de peixes, podendo indicar assim qual o tratamento mais eficaz para o determinado parasitismo.
Realizamos testes de MIC e MBC para empresas parceiras. Por definição, concentração inibitória mínima (MIC) é a concentração de antimicrobiano necessária para inibir o crescimento bacteriano, de forma que quanto menor a MIC, maior a potência e, quanto maior a potência, maior a dificuldade da bactéria em desenvolver resistência. Por outro lado, concentração bactericida mínima (MBC), por definição, é a menor concentração da droga que mata pelo menos 99,9% do inóculo bacteriano.
O conhecimento dos valores de MIC é de fundamental importância para a confirmação de resistências das bactérias e para testes in vitro de novos antibióticos. O teste de MBC é útil na comparação da atividade antibacteriana de diversos agente de uma só vez, todos sob as mesmas condições.
A histopatologia consiste na análise microscópica dos tecidos do cérebro, brânquias, fígado, rim, etc. para a detecção de possíveis lesões existentes, com a finalidade de informar ao clínico a natureza, a gravidade, a extensão, a evolução e a intensidade das lesões, além de sugerir ou até mesmo confirmar a causa da afecção. É uma importante ferramenta de suporte que auxilia na confirmação do diagnóstico.
O objetivo é fornecer o diagnóstico, ou então oferecer indícios que complementados com outras análises laboratoriais permitam chegarmos a um diagnóstico.
Procedimento para envio de material biológico
A piscicultura nacional muitas vezes é praticada em regiões remotas, e por diversos motivos (transportadora não disponível, tempo de duração do transporte, impossibilidade de manter os peixes sob refrigeração durante o transporte, entre outros) o envio de peixes vivos ou refrigerados para o laboratório é uma realidade difícil. Pensando nessas situações, a PREVET desenvolveu uma solução rápida para uma primeira triagem do agente ou dos agentes envolvidos em um dado surto. Nestas situações, com base nas informações do caso, o técnico da PREVET irá solicitar o envio do material a ser analisado imerso em etanol 90% (alevino/juvenil ou, mesmo do órgão desejado em situações em que a coleta pode ser realizada por uma pessoa treinada e sob condição de higiene adequada).