Relationship between volume and pressure for installation of the semi-automated in vitro gas production technique for tropical forage evaluation
versión impresa ISSN 0102-0935versión On-line ISSN 1678-4162
http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352003000200014
Relação entre pressão e volume para implantação da técnica in vitro semi-automática de produção de gases na avaliação de forrageiras tropicais
R.M. MaurícioI; L.G.R. PereiraII; L.C. GonçalvesIII; N.M. RodriguezIII
IFundação Ezequiel Dias Rua Conde Pereira Carneiro, 80 – Gameleira 30510-010 - Belo Horizonte, MG
IIDoutorando em Ciência Animal, Escola de Veterinária da UFMG
IIIEscola de Veterinária da UFMG
O trabalho teve como objetivo demonstrar o procedimento inicial para a instalação da técnica in vitro semi-automática de produção de gases em diferentes laboratórios, ou seja, estabelecer uma equação que estime o volume (V) de gases produzidos no interior dos frascos por meio de dados de pressão (P) e V, obtidos manualmente durante a fermentação de diferentes substratos. Foram utilizadas sete forrageiras: feno de Cynodon dactylon (tifton 85), Brachiaria brizantha (braquiarão), Neonotonia wightii (soja perene) e silagens de quatro genótipos de sorgo (Sorghum bicolor), que geraram 1036 dados de P e V. A equação relacionando V e P obtida foi: V = –0,004 (s.e. 0,06) + 4,43P (s.e. 0,043) + 0,051 P2(s.e. 0,007), R2 = 0,99, a qual permitiu a instalação da técnica in vitro semi-automática de produção de gases no laboratório de nutrição animal do Departamento de Zootecnia da Escola de Veterinária da UFMG.
Palavras-chave: in vitro, produção de gases, ruminantes, semi-automatização
The objective of this work was to demonstrate the first proceeding to install the semi-automated in vitro gas production technique in different laboratories. Therefore the relationship between volume of gas produced (V) and pressure generated (P) obtained manually by incubation of different substrates in fermentation bottles, should be estimated. Cynodon dactylon hay (tifton 85), Brachiaria brizanta (brachiarão), Neonotonia wightii (soja perene) and silages from four sorghum genotypes were incubated and generated 1036 values of P and V. The equation relating V and P was: V = -0.004 (s.e. 0.06) + 4.43P (s.e. 0.043) + 0.051P2 (s.e. 0.007), R2= 0.99. The equation allowed the installation of the semi-automated in vitro gas production technique at the Animal Nutrition Laboratory of the Animal Science Department of the Veterinary School of UFMG.
Keywords: in vitro, gas production, ruminants, semi-automated
As regiões tropicais caracterizam-se pelo grande número de espécies forrageiras com potencial para serem usadas na alimentação de ruminantes e a determinação do seu valor nutritivo é de grande importância. Ensaios in vivo que envolvem a produção animal e a digestibilidade são os métodos mais precisos para essa determinação. Isso traz dificuldades ao experimento pois requer o uso de animais, alimentos, mão-de-obra, tempo e elevado custo financeiro, limitando sua aplicabilidade.
Os métodos biológicos capazes de simular o processo digestivo, através de microrganismos ruminais in vitro (Tilley e Terry, 1963) ou in situ (Ørskov et al., 1980) têm sido utilizados como alternativa ao método in vivo para a avaliação de forrageiras. Entretanto, as desvantagens dos métodos in vitro e in situ, como não descrever a cinética da digestão ou superestimar a fermentação ruminal, respectivamente, têm resultado no emprego de outras técnicas, como por exemplo a produção de gases (Menke et al., 1979; Theodorou et al., 1994).
As técnicas in vitro de produção de gases são capazes de simular o ambiente ruminal e a digestão enzimática (Theodorou et al., 1994), além de descrever a cinética de fermentação ruminal e estimar o consumo (Blümmel, Ørskov, 1993). Dessa forma, elas têm se tornado uma opção para os estudos de forrageiras (Getachew et al., 1998).
As técnicas in vitro cujo princípio é a produção de gases (Menke et al., 1988; Theodorou et al., 1994; Malafaia et al., 1998; Cabral et al., 2000) baseiam-se na estimativa do volume de gases produzidos por meio da leitura direta com seringa graduada ou mesmo por predições do volume a partir de dados de pressão.
A técnica in vitro semi-automática de produção de gases (Mauricio et al., 1999a) foi desenvolvida na Universidade de Reading-Inglaterra (altitude de 66 m). A partir de dados experimentais, uma equação quadrática entre pressão (P) e volume (V) foi obtida viabilizando a estimativa do volume de gases produzidos dentro de cada frasco de fermentação. Para estimar o volume de gases através dos valores de pressão, inicialmente foi avaliado o uso da "lei dos gases" de Boyle e Gay-Lussac, em que: PG = Vs / Pa * Pt, sendo PG = produção de gases (ml), Vs = volume de gases na parte superior do frasco (ml), Pa = pressão atmosférica (psi) e Pt = pressão obtida pelo transdutor (psi). Entretanto, verificou-se que a lei não se aplica para estimar a produção de gases durante a fermentação no interior de frascos devido à difusão de gases na fase líquida, fator não considerado por ela. O desenvolvimento de uma equação estabelecendo a relação entre P e V (Mauricio et al., 1999a) eliminou as aferições manuais do V feitas através de seringas plásticas, como proposto na técnica de Theodorou et al. (1994). Essa modificação levou à redução no erro do operador, maior velocidade de leitura e aumento da capacidade do sistema (336 frascos). Dessa forma, a cinética, e mais especificamente o período inicial de fermentação denominado "lag phase", puderam ser descritos com maior acurácia, ou seja, maior número de pontos devido à redução nos intervalos de leituras do volume de gases produzidos. Essa mesma metodologia também foi aplicada para a implantação da técnica semi-automática (Mauricio et al., 1999a) em Piracicaba-SP, no Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA, altitude 780 m). Ao comparar os resultados da relação entre P e V no Brasil, no CENA (1 psi = 4,35 ml de gás) e na Inglaterra (1 psi = 3,95 ml), pode-se verificar a dependência dessas variáveis com a altitude local de cada laboratório (Mauricio et al., 1999b).
O objetivo deste trabalho foi demonstrar o procedimento operacional para a obtenção da equação, correlacionando pressão e volume como passo inicial para a implantação da técnica in vitro semi-automática de produção de gases em diferentes laboratórios.
Amostras de 1g de feno de Cynodon dactylon (tifton 85), Brachiaria brizantha (braquiarão), Neonotonia wightii (soja perene) e silagens de quatro genótipos de sorgo (BR700, BR701, BR601 e AG2002) foram incubadas em frascos de vidro (160ml) previamente injetados com CO2. Foram utilizados três frascos por tratamento. Frascos contendo somente líquido ruminal e meio de cultura (tampão) foram usados como controle. Para cada frasco, foram adicionados manualmente, utilizando uma proveta, 90ml de meio de cultura conforme Theodorou et al. (1994). Os frascos foram vedados com rolhas de borracha (14 mm) e seladas com anilhas de alumínio. Eles foram mantidos a 4ºC durante a noite e no dia posterior. Cinco horas antes da inoculação os frascos foram removidos da geladeira para a estufa à 39ºC, até o momento da inoculação. A inoculação foi feita usando líquido ruminal obtido de um bovino fistulado, mantido em dieta à base de silagem de sorgo e 1kg de concentrado por dia (20% de PB). O líquido ruminal foi retirado e armazenado em garrafas térmicas previamente aquecidas. No laboratório, o líquido ruminal foi filtrado através de duas camadas de gases de algodão sob injeção contínua de CO2 e mantido aquecido a 39ºC. A inoculação foi feita por meio de injeção de 10ml do inóculo por frasco, usando-se seringa plástica conectada a uma agulha (0,6 mm).
A pressão (psi = pressão por polegada quadrada) originada dos gases acumulados na parte superior dos frascos foi medida por meio de um transdutor de pressão tipo T443A (Bailey e Mackey, Inglaterra), conectado a uma válvula de três saídas. A primeira saída foi conectada a uma agulha (0,6 mm), a segunda conectada ao transdutor de pressão e a terceira a uma seringa plástica que serviu para a medição do volume. As leituras de pressão e volume foram tomadas com maior freqüência durante o período inicial de fermentação e reduzidas posteriormente (2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 19, 24, 30, 36, 48, 72 e 96 h). A partir da inserção da agulha na tampa de borracha a pressão produzida no interior dos frascos foi lida no leitor digital. Os gases acumulados foram retirados com uso da seringa no momento em que a pressão registrada no leitor chegasse a zero, confirmando a retirada total dos gases.
Os dados obtidos de pressão e volume durante a fermentação (1036 dados) foram utilizados para o cálculo da equação quadrática por meio do procedimento "Proc Reg" (SAS, 1988).
Para implantação da técnica semi-automática de produção de gases em diferentes laboratórios, faz-se necessário a obtenção de uma equação para predição do volume através da pressão, de acordo com a altitude de cada laboratório. Como foi demonstrado por Mauricio et al. (1999a), a obtenção do volume de gases produzidos pela lei de Boyle e Gay-Lussac não seria capaz de predizer o volume de gases produzidos durante a fermentação, e a solução encontrada foi obter uma equação a partir de dados experimentais. A relação entre pressão e volume obtida a partir de 1036 dados oriundos da fermentação de sete forrageiras encontram-se na Fig. 1.
Os valores de pressão variaram de 0 a 7,2 psi e os de volume entre 0 e 36ml. A faixa de pressão está dentro das recomendações de Theodorou et al. (1994), pois esses autores verificaram que somente valores de pressão acima de 7,0 psi causam instabilidade na correlação entre as variáveis.
A equação encontrada para os dados deste experimento foi: V (ml) = –0,004 (s.e. 0,06) + 4,43 P (s.e. 0,043) + 0,051 P2 (s.e. 0,007), (R2= 0,99). Ela difere das equações obtidas em outros locais, como a encontrada no CENA [V (ml) = 0,56 (s.e. 0,05) + 3,61 P (s.e. 0,035) + 0,18 P2 (s.e. 0,004), (R2= 0,98)] e na Inglaterra [V (ml) = 0,18 (s.e. 0,08) + 3,69 P (s.e. 0,052) + 0,08 P2 (s.e. 0,007), (R2= 0,99)].
Essas diferenças, provavelmente, estão diretamente relacionadas à altitude de cada laboratório: 836m em Belo Horizonte, 780m em Piracicaba e 66m em Reading. Apesar de as altitudes de Belo Horizonte (UFMG) e Piracicaba (CENA) serem próximas, as equações aparentemente diferiram-se em relação aos valores dos componentes da equação (Ex. intercepta de –0,004 para a UFMG e 0,56 para o CENA). Entretanto, para cada psi de pressão o valor estimado de volume na UFMG foi de 4,38 ml e para o CENA de 4,35 ml. Deve-se também ressaltar que nos três locais de estudo a proporcionalidade entre volume e altitude foi mantida, ou seja, maior altitude maior volume de gases (UFMG 1 psi = 4,38 e Inglaterra 1 psi = 3,95). A equação relacionando volume e pressão encontrada neste trabalho, comparada às demais, demonstra que a instalação da técnica semi-automática requer a obtenção de equações específicas para cada local e respectiva altitude. Essa prática permite maior rapidez nas leituras durante a fermentação e menor intervalo entre as leituras, favorecendo assim a maior acurácia na descrição do perfil de fermentação ruminal simulado pela técnica e incrementando o número de amostras por experimento.
Este trabalho demonstrou o procedimento para obtenção da equação entre volume e pressão, a qual permitiu a instalação da técnica in vitro semi-automática de produção de gases no laboratório de nutrição animal do Departamento de Zootecnia da Escola de Veterinária da UFMG. A equação foi diferente das obtidas em outros locais.
BLÜMMEL, M.; ØRSKOV, E.R. Comparison of "in vitro" gas production and naylon degradability of roughage in predicting feed intake in cattle. Anim. Feed Sci. Technol., v.40, p.109-119, 1993. [ Links ]
CABRAL, L.S.; VALADARES FILHO, S.C.; MALAFAIA, P.A.M. et al. Frações de carboidratos de alimentos volumosos e suas taxas de degradação estimadas pela técnica de produção de gases. Rev. Bras. Zootec., v.29, p.2087-2098, 2000. [ Links ]
GETACHEW, G.; BLÜMMEL, M.; MAKKAR, H.P.S. et al. In vitro gas measuring techniques for assessment of nutritional quality of feeds: a review. Anim. Feed Sci. Technol., v.72, p.261-281, 1998. [ Links ]
MALAFAIA, P.A.M.; VALADARES FILHO, S.C.; VIEIRA, R.A.M. et al. Cinética ruminal de alguns alimentos investigada por técnicas gravimétricas e metabólicas. Rev. Bras. Zootec., v.27, p.370-380, 1998. [ Links ]
MAURICIO, R.M.; MOULD, F.L.; DHANOA, M.S. et al. A semi-automated in vitro gas production technique for ruminants fedstuff evaluation. Anim. Feed Sci. Technol., v.79, p.321-330, 1999a. [ Links ]
MAURICIO, R.M.; OWEN, E.; ABDALLA, A.L. et al. Comparison of rumen liquor and faeces, in UK and Brazil, as sources of microorganisms for in vitro gas production for assessing twelve forages. Proceedings of the British Society of Animal Science, p.148, 1999b. [ Links ]
MENKE, K.H.; STEINGASS, H. Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid. Anim. Res. Develop., v.28, p.7-12, 1988. [ Links ]
ØRSKOV, E.R; HOVELL, F.D.B.; MOULD, F. The use of the nylon bag technique for evaluation of feedstuffs. Trop. Anim. Produc., v.5, p.195-213, 1980. [ Links ]
SAS. User`s Guide: Statistics. SAS Institute, Raleigh, NC, 1989. [ Links ]
THEODOROU, M.K.; WILLIAMS, B.A.; DHANOA, M.S. et al. A simple gas production method using a pressure transducer to determine the fermentation kinetics of ruminant feeds. Anim. Feed Sci. Technol., v.48, p.185-197, 1994. [ Links ]