https://doi.org/10.1590/S0103-84782004000100004
DEFESA FIOTOSSANITARIA
Population densities of Ralstonia solanacearum on potato cultivars in the field
João Leodato Nunes MacielI; Valmir DuarteII,1; José Ricardo Pfeifer SilveiraIII
IEngenheiro Agrônomo, Doutor, Estação Experimental do Arroz, Instituto Rio-Grandense do Arroz (EEA-IRGA), Cachoeirinha, RS
IIEngenheiro Agrônomo, Ph.D., Professor Adjunto, Departamento de Fitossanidade, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, CP 776, 91540-000, Porto Alegre, RS, fax: (51) 3316-6016, E-mail: valmir@ufrgs.br
IIIEngenheiro Agrônomo, Doutor, Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária (FEPAGRO), Porto Alegre, RS
Palavras-chave: murcha bacteriana, Solanum tuberosum, ELISA, imunofluorescência.
The occurrence of latent populations of Ralstonia solanacearum on potato (Solanum tuberosum) plants may represent inoculum source of unknown potential. Besides, it is also unknown if the latent population of the bacterium is lower in resistant than in susceptible cultivars. In order to study these points, an experiment was conducted in the field in two locations in Rio Grande do Sul State, Brazil. The objective was to verify the relationship between R. solanacearum population density and the potato cultivar resistance. The experiment was conducted in Eldorado do Sul, during the Spring, and in Caxias do Sul, during the Fall. Tubers of Achat, Baronesa, Elvira, Macaca, Monte Bonito, and Trapeira cultivars were inoculated with a R. solanacearum strain, biovar II, and planted in the field. Population density of the bacterium was estimated in the assymptomatic and wilted plants, by ELISA and imunofluorescence techniques. No evidence of relationship between population density of R. solanacearum and cultivar was found. Besides, the population density on Achat, known as the most resistant, one was similar to the other cultivars.
Key words: bacterial wilt, Solanum tuberosum, ELISA, imunofluorescence.
Um dos principais entraves para o sucesso no controle da murcha bacteriana da batata, causada por Ralstonia solanacearum, tem sido a capacidade da bactéria sobreviver e ser disseminada sob a forma de infecções latentes (GRAHAM et al., 1979; CIAMPI & SEQUEIRA, 1980; HAYWARD, 1991). No Brasil, tal situação é preocupante, uma vez que 70% dos produtores de batata-consumo de nosso país utilizam, como batatas-semente para o plantio, tubérculos colhidos de lavouras não submetidos a qualquer programa de inspeção de doenças e, em particular, de murcha bacteriana (LOPES, 1994). Além disso, é desconhecido o potencial que plantas das cultivares de batata plantadas no Brasil, principalmente das consideradas mais resistentes, representam como fonte de inóculo.
Na Europa, programas de melhoramento de batata e tomate têm considerado a baixa taxa de infecção latente por R. solanacearum como critério para seleção de genótipos (GRYMSLEY & WANG, 1998). No Canadá, De BOER & MCCANN (1989; 1990) verificaram que a densidade populacional de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus em plantas e tubérculos de cultivares resistentes, sob a forma latente, foi igual ou superior àquela registrada em cultivares suscetíveis. Em função destes resultados, a produção de batatas-semente naquele país, é monitorada para verificar a incidência do patógeno, através de um sistema de amostragem e da utilização de técnicas imunológicas e moleculares para detecção (McDONALD & BORREL, 1991).
Técnicas ou procedimentos que permitem a detecção ou quantificação de bactérias fitopatogênicas constituem-se em ferramentas de grande utilidade em estudos epidemiológicos, certificação de sementes e rotinas quarentenárias. Neste contexto, células de R. solanacearum presentes em plantas, tubérculos, rizomas, sementes e no solo têm sido detectadas e quantificadas através do uso de estirpes mutantes resistentes a antibióticos, da técnica de PCR e de procedimentos sorológicos como as técnicas de ELISA e de imunofluorescência (MOFFET et al., 1983; Van VUURDE, 1990; ROBINSON, 1993; ELPHINSTONE, 1994; ELPHINSTONE et al., 1996). Os resultados têm indicado que nem sempre a presença de R. solanacearum significa a ocorrência de sintomas da doença.
Assim, um experimento de campo foi conduzido em dois locais no RS com o objetivo de verificar a existência de relação entre o grau de resistência de cultivares a murcha bacteriana e a densidade populacional de R. solanacearum.
O experimento foi conduzido na primavera, em 1996, na Estação Experimental Agronômica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (EEA/UFRGS), Eldorado do Sul, e no outono, em 1998, no Centro de Pesquisa de Agroindústria da Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária (CPA/FEPAGRO), Caxias do Sul. A EEA/UFRGS está localizada às margens da rodovia BR-290, Km 146, entre as latitudes 30º 05' e 30º 15' sul, e longitudes 51º 30' e 51º 45' oeste, apresentando altitude média de 46m. Situa-se em uma região que, segundo a classificação de Köeppen, apresenta clima subtropical úmido, com verão quente, sendo uma transição entre os tipos fundamentais Cfa1 (isoterma anual inferior a 18ºC). A temperatura média do mês mais frio é 14,8ºC, a média anual é 19,6ºC e a média anual máxima 24,3ºC. A precipitação pluviométrica média anual é 1440mm. Fósforo (200kg ha-1 de P2O5), potássio (90kg ha-1 de K2O) e calcário (200kg ha-1) foram incorporados durante o preparo do solo e plantio. O nitrogênio foi aplicado nas doses de 100kg ha-1 e 60kg ha-1 nos cultivos de primavera e de outono, respectivamente. Nos dois cultivos, foram utilizados tubérculos das cultivares Baronesa, Macaca, Monte Bonito e Trapeira (batatas-semente básica); e Achat e Elvira (batatas-semente certificada). Cada cultivar foi submetida a dois tratamentos; 40 tubérculos foram mergulhados em solução tampão de fosfato (STF) (PO4-2, 0,01 M, pH 7,2), e outros 40 em STF contendo células da estirpe Rsol-2r+c+e+ de R. solanacearum (4,7 x 107 UFC ml-1), biovar II, raça 3 (YOSSEN et al., 1998). De cada tratamento, 8 tubérculos de cada cultivar foram plantados em parcelas de 2,4 x 1m, em delineamento de blocos casualizados. Com esta distribuição, cada tratamento teve cinco parcelas para cada cultivar. Em ambos os cultivos, o fungicida chlorothalonil foi aplicado aos 35 e 50 dias após o plantio na dose de 150g i.a.100L-1 de água.
A incidência de plantas murchas ou mortas em cada parcela foi registrada aos 42 dias após o plantio, no cultivo de primavera e, aos 40, no de outono. Para efeito de análise, considerou-se a incidência percentual de plantas sintomáticas nas parcelas com tubérculos inoculados, transformada em considerando os dados obtidos dos dois cultivos.
Aos 21, 42 e 68 dias após o plantio, no cultivo de primavera, e aos 24, 40 e 58, no de outono, plantas ou brotações laterais de plantas com ou sem sintomas de murcha foram coletadas. As amostras foram pesadas e transferidas para sacos plásticos contendo tampão de extração para ELISA (NaCl, 8; K2PO4, 0,2; Na2HPO4, 1,15; KCl, 0,2; NaN3, 0,2g L-1; pH 7,4 mais polyvinilpyrrolidone, 20; leite desnatado em pó, 0,01; tween-20, 0,5g L-1) na proporção de 2:1 (tampão de extração: peso da amostra). As amostras foram trituradas nos sacos plásticos e mantidas à -20ºC até que todas as coletas de cada cultivo fossem feitas.
Utilizou-se o protocolo proposto pelo Centro Internacional de La Papa para execução do método do sanduíche duplo com anticorpo policlonal reativo contra R. solanacearum produzido pelo CPACT-EMBRAPA (CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA, 1990; CASTRO et al., 1993). De cada amostra, 100ml do macerado em tampão de extração foi colocado em cada célula das placas de poliestireno (Nunc-Immunoplate, Maxisorp). A leitura da absorbância das reações foi feita em espectrofotômetro, em luz visível, a 405Ηm. Suspensões de R. solanacearum (1010 UFC ml-1) e de Xanthomonas axonopodis pv. citri em tampão de extração foram utilizados como controles positivo e negativo, respectivamente. De cada grupo de amostras, assintomáticas e sintomáticas, e de cada coleta, cinco amostras de cada cultivar foram submetidas duas vezes ao ELISA. Para análise de variância, as leituras de absorbância originais, correspondentes aos dados obtidos das amostras de plantas assintomáticas e sintomáticas, foram transformadas para e , respectivamente.
Um ml de cada amostra triturada em tampão de extração foi diluído até 10-10. Alíquotas de 20ml de cada diluição foram colocados no centro de círculos marcados em lâminas de vidro. Os demais procedimentos para quantificação da bactéria nas amostras utilizando a técnica de imunofluorescência foram os mesmos descritos por Van VUURDE (1990), sendo que o antissoro foi o mesmo utilizado no ELISA. A contagem das células bacterianas foi realizada com auxílio de microscópio de luz ultravioleta e lentes de 400 e 540 vezes de aumento. De cada grupo de amostras, assintomáticas e sintomáticas, e de cada coleta, três amostras de cada cultivar foram submetidas aos procedimentos de imunofluorescência. Para análise de variância, o número de unidades de imunofluorescência (UIF) g-1 de tecido vegetal, correspondentes aos dados obtidos das amostras de plantas assintomáticas e sintomáticas, foram de transformados para log x+10 e log x+1, respectivamente.
As cultivares foram diferentes entre si quanto ao grau de resistência a murcha bacteriana somente durante o cultivo de primavera (Tabela 1), sendo a cultivar Achat a mais resistente. A Baronesa, que tem sido caracterizada como muito suscetível à doença, segundo LOPES (1994), não diferiu das cultivares Trapeira e Monte Bonito, que foram as mais suscetíveis.
Nas amostras de plantas assintomáticas, na média de cada um dos dois cultivos, verificou-se que houve diferença nos valores de absorbância nas reações do ELISA somente da cultivar Baronesa em relação ao controle (Tabela 2). Além disso, nos dois cultivos, as cultivares não se diferenciaram entre si e, inclusive do controle, em nenhuma das três avaliações realizadas em cada cultivo (dados não mostrados). Entre as amostras de plantas sintomáticas, não se verificou diferença entre as quatro cultivares nas duas avaliações iniciais realizadas durante o cultivo de primavera. A diferença foi constatada somente na última coleta em que os valores de absorbância das amostras da cultivar Monte Bonito foi superior às demais.
Através de técnicas de imunofluorescência, constatou-se que, entre as plantas assintomáticas, as cultivares não se diferenciaram na média do cultivo de outono (Tabela 2). No entanto, na média do cultivo de primavera, a população estimada na cultivar Baronesa foi superior à população na cultivar Macaca. A densidade populacional média de R. solanacearum presente nas plantas assintomáticas das seis cultivares foi de 7,86 x 103 e 7,94 x 101 UIF g-1 de tecido vegetal nos cultivos de primavera e outono, respectivamente. Entre as plantas sintomáticas, não foi verificada diferença entre as cultivares quanto à densidade populacional da bactéria em nenhuma das três avaliações realizadas.
No cultivo de primavera, aos 21 dias após o plantio, devido a ausência de plantas com sintomas de murcha bacteriana, não se coletaram amostras de plantas sintomáticas das cultivares Baronesa e Macaca, e a comparação da densidade populacional da bactéria foi realizada somente entre plantas das cultivares Achat, Elvira, Monte Bonito e Trapeira. A análise da variância dos dados, das avaliações feitas em plantas sintomáticas durante o cultivo de primavera, indicou apenas interação entre os fatores densidade populacional e época de avaliação. No cultivo de outono, devido à ocorrência de murcha bacteriana apenas em plantas das cultivares Macaca e Monte Bonito, a comparação entre densidades populacionais nas seis cultivares não foi realizada, pois não se coletaram amostras de plantas sintomáticas.
Os resultados obtidos indicam que não houve relação entre o grau de resistência e a densidade populacional de R. solanacearum sob a forma latente ou assintomática durante a fase vegetativa da cultura. Isto foi verificado mesmo que a população da bactéria na cultivar Baronesa, que se caracterizou como sendo uma das três cultivares mais suscetíveis (Tabela 1), tenha sido superior ao controle quando se utilizou ELISA e à cultivar Macaca na média do cultivo de primavera, quando se utilizou a técnica de imunofluorescência. Esta tendência da população ser superior na cultivar Baronesa pode ser um indicativo que a utilização de técnicas mais sensíveis de detecção ou quantificação, como a da PCR, pode fornecer melhores informações sobre relação entre o grau de resistência de genótipos de batata e a densidade populacional da bactéria. Por outro lado, as informações obtidas ajudam a elucidar aspectos relacionados à potencialidade que plantas das cultivares de batata mais utilizadas no Brasil representam como substrato de sobrevivência e manutenção de inóculo de R. solanacearum. Levando-se em consideração que a cultivar Achat tem demonstrado ser a mais resistente entre as recomendadas para cultivo no Brasil (Tabela 1), ressalta-se a condição de igualdade verificada entre as densidades populacionais da bactéria nesta cultivar em comparação com as outras cultivares utilizadas no experimento. Também foram registradas, em algumas avaliações feitas em plantas assintomáticas das cultivares Baronesa, Elvira e Achat, densidades populacionais que variaram de 104 a 105 UIF g-1 de tecido vegetal. Estes níveis populacionais são preocupantes, pois são iguais àqueles obtidos em algumas avaliações feitas em plantas sintomáticas (Tabela 3) e reforça o interesse em se obter genótipos que sejam resistentes a murcha bacteriana, mas que também não permitam que a taxa de infecção latente da bactéria seja alta. A ausência de mais dados sobre a população latente em plantas das cultivares de batata recomendadas para cultivo no Brasil impede que se tenha um padrão de comparação para associar as densidades populacionais observadas neste trabalho com a capacidade epidemiológica de cada cultivar manter o inóculo da bactéria na lavoura. No entanto, a importância de se estabelecer o grau de desenvolvimento de populações latentes em diferentes cultivares reside na possibilidade de, além de estimar a contribuição de cada cultivar para manutenção ou disseminação de inóculo do patógeno, relacionar densidades de população latente de R. solanacearum com parâmetros de produção e produtividade. Em amendoim, tem sido determinado que populações latentes do patógeno, em cultivares resistentes, tem afetado vários aspectos relacionados com a produtividade das cultivares, tais como, resistência à seca, fixação biológica de nitrogênio e proliferação de raízes (LIAO et al., 1998).
Atualmente a seleção de cultivares resistentes a murcha bacteriana é realizada utilizando-se, como critério, a visualização de plantas com sintomas. Considerando que plantas assintomáticas podem hospedar o patógeno com alta taxa densidade populacional, a observação visual não garante ausência da bactéria. A utilização de técnicas mais rápidas e sensíveis facilitam e agilizam o estudo da população latente. Entretanto, apesar da determinação do grau de resistência de cultivares, baseada na incidência de sintomas não ser totalmente elucidativo sobre a dinâmica populacional de R. solanacearum, este tipo de avaliação ainda é essencial devido ao seu menor custo e maior praticidade e viabilidade.
Considerando as três avaliações realizadas, nenhuma das técnicas indicou diferença entre a densidade populacional de R. solanacearum presente em plantas murchas das seis cultivares. Este resultado está de acordo com os obtidos por GRIMAULT et al. (1994), os quais indicaram que a densidade populacional de R. solanacearum (biovar I) em plantas de tomate com sintomas de murcha apresentava a mesma densidade aos 24 e 34 dias após a inoculação. Um dos prováveis principais motivos que contribuiu para a ocorrência da interação registrada nas plantas sintomáticas entre os fatores densidade populacional, determinado pelas duas técnicas, e época de avaliação, foi a existência de cultivares com ciclos diferentes. Tal situação pode ter influenciado a dinâmica populacional da bactéria nas diferentes cultivares.
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