Inicialmente, a região era habitada por diversas tribos indígenas,[14] todas pertencentes ao tronco Tupi; as tribos do interior eram chamadas de Botocudos,[14] sendo-lhes atribuído comportamento hostil e belicoso, além da prática de antropofagia.[15] No litoral, as tribos também eram hostis, porém de hábitos um pouco diferentes.[14]
Na região Sul do actual estado e na região da serra do Caparaó, as tribos não eram hostis,[14] e o seu nome deriva de seu hábito de levar os visitantes para "ouvir o silêncio" da Serra do Castelo.[14] As demais tribos eram os aimorés e os goitacás.[14]
Em 23 de maio de 1535, o fidalgo português Vasco Fernandes Coutinho, veterano das campanhas da África e da Índia, aportou em terras da capitania, que lhe destinara o rei D. João III.[16] Como era um domingo do Espírito Santo, chamou de vila do Espírito Santo a povoação que mandou construir nas terras que lhe couberam: cinquenta léguas de costa, entre os rios Mucuri e Itapemirim,[17] com outro tanto de largo, sertão adentro, a partir do ponto em que terminava, ao norte, o quinhão concedido a Pero de Campos Tourinho, donatário da capitania de Porto Seguro.[18] A Vila do Espírito Santo é hoje a cidade de Vila Velha.[19] Ainda em 1535, a vila passou à capitania, em 1822 província e em 1889 a estado.
A fixação da vila foi uma história de lutas, pois os índios não entregaram aos portugueses, sem resistência, suas roças e malocas. Recuaram até a floresta, onde se concentraram para iniciar uma luta de guerrilhas que se prolongou, com pequenas tréguas, até meados do século XVII.[18] Foi assim das mais duras a empresa cometida a Vasco Fernandes Coutinho. Para o patriarca do Espírito Santo a capitania foi um prêmio que se transformou em castigo; teve de empenhar todos os haveres para conservar sua vila; acabou por morrer pobre e desvalido.[18]
Além da insubmissão dos indígenas, o donatário teve de enfrentar as dissensões entre os portugueses. A seus companheiros Jorge de Meneses e Duarte Lemos concedera extensas sesmarias, usando os poderes que recebera juntamente com a carta de doação. Com isso, criou dois rivais implacáveis.[18]
Duarte de Lemos fundou Vitória — chamada de Vila Nova — na ilha de Santo Antônio, em posição estratégica, mais vantajosa que Vila Velha para a defesa contra os constantes ataques dos silvícolas. Para lá se transferiu a sede da capitania. À mesma época, chegaram os missionários jesuítas, empenhados na catequese, o que provocou choques com os colonos, que preferiam a dominação do gentio pela escravidão. A presença do padre José de Anchieta deu um sentido muito especial à ação dos padres da Companhia de Jesus em terras do Espírito Santo. Desde 1561, Anchieta elegera para seu refúgio a aldeia de Reritiba, de onde teve de se afastar constantemente, em virtude de seus encargos, ora em São Paulo, no Rio de Janeiro ou na Bahia. Dois poemas escreveu ele em Reritiba: "De Beata Virgine dei Marte Maria" ("Da Santa Virgem Maria Mãe de Deus") e "De gestis Mendi de Saa" ("Dos feitos de Mem de Sá"). Neste último, está descrita a epopeia de uma esquadra enviada da Bahia por Mem de Sá, governador-geral do Brasil, em socorro a Vasco Fernandes Coutinho e sua gente, que estavam sob cerco dos tamoios na ilha de Vitória. A maior força dos gentios estava concentrada numa aldeia forrificada junto ao rio Cricaré. Ali ocorreu a batalha decisiva, em 22 de maio de 1558. Os portugueses, embora vitoriosos, sofreram pesadas baixas. Entre os mortos estavam o próprio filho de Mem de Sá, Fernão de Sá, que comandava a esquadra; e dois filhos de Caramuru (Diogo Álvares Correia) com a índia Paraguaçu.[20]
A posição estratégica da capitania, dada a proximidade com o Rio de Janeiro, ocasionou algumas tentativas estrangeiras de invasão. Em 1592, os capixabas rechaçaram uma investida dos ingleses, sob o comando de Thomas Cavendish. Em 1625, o donatário Francisco de Aguiar Coutinho enfrentou a primeira investida dos holandeses, comandados por Pieter Pieterszoon Heyn,[20] luta em que se destacou a heroína capixaba Maria Ortiz.[21] Em 1640, com sete navios, os holandeses atacaram novamente o Espírito Santo, sob o comando do coronel Koin. Conseguiram desembarcar 400 homens, mas foram repelidos pelo capitão-mor João Dias Guedes e não se firmaram em Vitória. Atacaram então Vila Velha, de onde foram também rechaçados. O governo colonial, diante de tão repetidos ataques, resolveu destacar para Vitória quarenta infantes da tropa regular.[20] Nessa oportunidade a capitania progride e Koin captura duas naus carregadas de açúcar que, atingidas pelo fogo de terra, ficam com a carga quase toda avariada.[20]
O esgotamento da população, que nos primeiros tempos, por diversas vezes, ameaçara desertar a capitania, bem como a incapacidade de dar seguimento a sua incipiente agricultura, denunciavam a fraqueza dos alicerces em que se baseava a colonização local. Também aí os recursos particulares revelaram-se insuficientes para manter empresa tão árdua e onerosa.[20]
Em 1627, morreu o donatário Francisco de Aguiar Coutinho, cujo sucessor, Ambrósio de Aguiar Coutinho, não se interessou pelo senhorio e continuou como governador nos Açores. Sucederam-se os capitães-mores, com frequentes e sérias divergências entre eles e os oficiais da câmara. Ao atingir a maioridade, em 1667, Antônio Luís Gonçalves da Câmara Coutinho, último descendente do primeiro donatário, conseguiu a nomeação para capitão-mor de Antônio Mendes de Figueiredo, governante operoso e estimado. Em 1674 efetuou-se a compra do território ao último donatário da família Câmara Coutinho pelo fidalgo baiano Francisco Gil de Araújo, por quarenta mil cruzados, transação confirmada por carta régia de 18 de março de 1675.[20]