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Um nucléolo é uma estrutura especializada no núcleo, que é formado a partir de vários cromossomas e é ativa na síntese de ribossomas.
O nucléolo tem inúmeras outras funções, incluindo a montagem de partículas de reconhecimento do sinal, modificação de RNAs de transferência e sentindo o estresse celular. O Nucléolo tem aspecto de grânulo, mas não é limitado por membrana. É o centro de produção de ribossomos.
Fonte: www.lb.ufs.br
O nucléolo, também chamado de nucléolos, é uma estrutura celular encontrada dentro do núcleo de células eucarióticas. Pode haver muitas nucléolos dentro de um único núcleo da célula, apesar de todas as células humanas normais possuirem apenas um nucléolo. É composto de ácidos nucleicos e proteínas e é responsável pela transcrição e montagem de ácido ribonucleico ribossómico (RNA). ARNr é um componente importante dos organelos celulares conhecidos como ribossomas, os quais produzem proteínas para utilização pela restante da célula.
Núcleo de uma célula é frequentemente descrito como o seu "centro de controle", como ele contém muito da informação genética importante da célula. O núcleo também contém um número de estruturas a que se refere a organismos como subnucleares, dos quais o nucléolo é um dos mais bem conhecidos. Nucléolos são encontrados no núcleo em torno de regiões cromossômicas denominadas regiões organizadoras de nucléolo.
A transcrição de RNAr ocorre dentro desta estrutura. A transcrição é um processo em que o RNAr é sintetizado utilizando as sequências existentes genéticas encontradas no ácido desoxirribonucleico (ADN) como um modelo. Existem três fases principais deste processo: a iniciação, a cadeia de alongamento e terminação.
Na fase de iniciação de RNAr transcrição, enzimas que promovem a ação de outras enzimas - chamadas polimerases de RNA - se ligam a genes em uma fita de DNA. Em seguida, as enzimas de ARN polimerase analisar e copiar a cadeia de ADN, que é um dos dois fios que formam a dupla hélice de ADN. A outra cadeia complementar de DNA é o que as enzimas recriam. A terminação é o fim do processo que ocorre em diferentes razões em células eucarióticas e células procarióticas como as bactérias.
Depois RNAr foi transcrito no nucléolo, que é combinado com uma variedade de moléculas de proteína. Em seguida, o RNAr e as proteínas são montados em duas subunidades, um grande e um pequeno, que irá, eventualmente, combinam-se para criar um único ribossoma. Estas subunidades deixar o núcleo da célula através de poros encontrados na membrana nuclear. Eles entram no citoplasma da célula, onde se juntam para formar um ribossoma funcional. Uma vez que a função principal 'ribossomas num organismo humano é a síntese de proteínas a partir de aminoácidos, as células que precisam de mais proteína de forma a funcionar tendem a ter maiores nucléolo.
A principal função do nucléolo é a produção de subunidades que formam os ribossomos. Os ribossomos são conhecidos para produzir / fabricar proteínas e, portanto, o nucléolo desempenha um papel indireto na síntese de proteínas.
Subunidades ribossomais A montagem das subunidades ribossomais ocorre da seguinte maneira. Transcrição da molécula precursora rRNA do DNA ocorre no nucléolo. Esta molécula precursora longa rRNA é processada e 3 RNAs maduros são formados.
O próximo passo após a formação de RNAs maduros a realização das embalagens. Estes RNAs são embalados com certas formas específicas de proteínas e, finalmente, as unidades ribossomais são formadas. Estas unidades ribossomais podem variar de tamanho.
Biogênese do mRNA Os nucléolos são conhecidos por desempenhar um papel importante na biogênese do mRNA. O núcleo também está envolvido no metabolismo de RNA.
Região do Nucléolo O NOR é a região na qual a formação do nucléolo ocorre em torno de cromossomos. Depois da divisão do núcleo, essa região fica associada ao núcleo. Várias cópias de genes de RNAs ribossomais estão contidas nesta área.
As diferentes funções de nucléolo são explicadas no artigo acima. A estrutura e o funcionamento do nucléolo são muito mais complicados do que aquilo que foi estudado até agora.
Esforços estão sendo feitos para estudar o trabalho de nucléolos em um nível molecular. Isso ajudaria a compreender mais sobre as macromoléculas envolvidas em diferentes funções. Fonte: www.vidaesaude.org
Nucléolo é um organóide presente em células eucarióticas, ligado principalmente à coordenação do processo reprodutivo das células (embora desapareça logo no início da divisão celular) e ao controle dos processos celulares básicos, pelo fato de conter trechos de DNA específicos, além de inúmeras proteínas associadas ou não a RNAr.
O nucléolo tem por função a organização dos ribossomos. Quanto maior o seu número e tamanho, maior é a síntese protéica da célula. A porção fibrilar densa é mais central e é formada por RNAr (RNA ribossômico) e proteínas ribossomais. A porção granular é mais periférica e é formada por subunidades ribossômicas em formação. A região organizadora do nucléolo é a cromatina associada ao nucléolo, que na divisão encontra-se nos satélites dos cromossomos acrocêntricos. Não é uma estrutura compacta, pois nota-se a invasão do nucleoplasma. Forma os ribossomos a partir das proteínas ribossômicas, que são importadas do citoplasma e se associam com o RNAr.
Uma região distinta, localizada no interior da maior parte dos NÚCLEOS CELULARES eucarióticos, não delimitada por uma membrana, na qual algumas espécies de rRNA (rna ribossômico) são sintetizados e reunidos em subunidades de ribonucleoproteínas ribossômicas. No nucléolo, o rRNA é transcrito a partir de um organizador nucleolar, isto é, um grupo de genes cromossômicos repetidos que decodificam o rRNA e que são transcritos pela rna polimerase i.
Os nucléolos são estruturas esféricas e densas que se coram intensamente. Têm um diâmetro de 1 a 3um e se alojam dentro dos núcleos.
Ao microscópio eletrônico o nucléolo aparece como uma massa densa e compacta, com cavidades cheias de cromatina. Sob maiores aumentos se comprova que o nucléolo apresenta áreas constituídas por grânulos e áreas compostas de fibrilas.
A parte fibrilar (F) é constituída de DNA e a parte granular (G) consiste em partículas precursoras das subunidades ribossômicas no processo de maturação. Terminado o processo, estas subunidades migram para o citoplasma e vão formar os ribossomos.
A maior parte do RNA do nucléolo é sintetizada ao nível da cromatina não-condensada, situada no interior do nucléolo, mais especificamente na região organizadora do nucléolo (RON). O que é nucléolo?
.Nele ocorre a transcrição dos RNAs ribossómicos (rRNAs) e o seu processamento, ocorrendo a síntese de ribossomas, necessários em quantidades variáveis, para síntese protéica. Morfologicamente os nucléolos possuem 3 regiões distintas: Componente fibrilar denso onde ocorre a transcriçaõ pela RNA polimerase I e se inicia o processamento do pré-rRNA; Centro fibrilar que contem cópias dos genes do rRNA não transcritos activamente; Componente granular onde o processamento do pré-rRNA continua e se dá a união das proteínas ribossomais ao pré-rRNA. Fonte: www.virtual.epm.br
O nucléolo é a estrutura celular mais facilmente visível, mesmo sem coloração e in vivo, em microscopia de luz comum, o que é possível graças ao seu índice de refração mais elevado do que o dos outros elementos do núcleo e do citoplasma. Embora já tivesse sido descrito por Fontana, em 1781, sua denominação, como a conhecemos hoje, foi dada por Valentin, somente em 1839 .
O nucléolo é a organela celular cuja função é produzir ribossomos. Seu tamanho e forma dependem do estado funcional celular, variando conforme a espécie e, dentro de uma espécie, de tecido para tecido e mesmo de célula para célula. Muitas vezes o nucléolo é visto próximo à periferia nuclear, porém essa não é uma regra fixa. Quanto mais forte a sobrecarga funcional celular, maior será o nucléolo. É o que ocorre em células em processo de secreção (células glandulares e neurônios) e em muitas células tumorais. Por outro lado, como exemplo de células com nucléolos pequenos, temos as células endoteliais e as da glia. Podem ser observados um ou mais nucléolos por núcleo, porém a maioria das células possui apenas um nucléolo (Figuras 9.1a e 9.1b). Hepatócitos, células vegetais e células animais em cultura são alguns exemplos de células em que ocorre mais de um nucléolo (Figuras 9.1a e 9.1b). No caso extremo de oócitos de anfíbios, podem ser encontrados, em algumas circunstâncias, até 3.000 nucléolos por núcleo. Núcleos poliplóides, ou seja, com vários lotes do genoma, geralmente contêm mais nucléolos do que núcleos diplóides.
A falta de uma membrana ao redor do nucléolo pode significar que não exista barreira para difusão entre nucléolo e nucleoplasma. O nucléolo se associa a sítios cromossômicos específicos (zonas organizadoras do nucléolo, NOR) que carregam os genes codificadores dos RNAr mais pesados. Pode ocorrer uma única NOR por lote cromossômico haplóide. No entanto, dois nucléolos podem se fundir ou uma zona organizadora do nucléolo pode se encontrar distribuída em mais de um cromossomo do lote haplóide. Nos seres humanos, por exemplo, os genes para RNAr se situam nas extremidades de cinco diferentes pares cromossômicos. É comum também se observar uma região de heterocromatina em íntima associação com a NOR. Em hepatócitos de roedores, a heterocromatina se distribui ao redor do nucléolo 3 (Figuras 9.2a e 9.2b), enquanto o inverso ocorre em hemípteros sugadores de sangue 4 (Figuras 9.3a-c). Durante o ciclo celular, podem ocorrer alterações na forma e tamanho dos nucléolos. Costuma-se afirmar que, durante a divisão celular, os nucléolos desaparecem a partir do fim da prófase, reaparecendo no final da telófase. Há, no entanto, exceções à regra. 4 (Figura 9.5g).
Ultra-estrutura e classificação dos nucléolos Ao microscópio eletrônico, são detectáveis nos nucléolos áreas ricas em elementos granulares (grânulos com diâmetro ao redor de 15 a 20 nm) e áreas predominantemente fibrilares (3 a 4 nm de espessura), que variam em disposição tridimensional, conforme o tipo celular analisado. Com base nessas observações, foram propostas várias classificações dos nucléolos, sendo a mais simples e objetiva aquela que contempla a grande maioria dos casos estudados e que pressupõe três categorias:
1. nucléolos reticulados, com nucleolonema, estrutura filamentosa trabeculada com aproximadamente 1.000 nm de espessura e contendo em seu corpo, predominantemente, elementos granulares de ribonucleoproteína (RNP), mas também elementos fibrilares (Figura 9.4a)
2. nucléolos compactos, no qual os elementos se superpõem e se anastomosam numa massa única compacta. São observados, principalmente, em células em proliferação, podendo se tratar de uma primeira etapa de desenvolvimento de um nucléolo que será do tipo 1, ou mesmo surgir em condições que resultem em inibição ou bloqueio de síntese de RNA nucleolar (Figura 9.4b)
3. nucléolos com camadas concêntricas, em que a porção central é representada pelo elemento fibroso e a camada cortical, periférica, contém os elementos granulares. Esse tipo de nucléolo é muito comum em oócitos de anfíbios (Figura 9.4c). Nessas células, as duas camadas, central e cortical, podem ser muito bem discriminadas até com um microscópio de luz (microscopia de fase) e separadas por choque osmótico com soluções salinas de NaCl ou KCl de baixa molaridade, ou água deionizada, a partir de nucléolos previamente isolados com pinças, sob lupa. Fazem também parte dos elementos fibrilares do nucléolo os centros fibrilares, que se distribuem formando áreas pequenas, circulares e eletrolúcidas, circundadas por um componente fibrilar denso, de caráter eletrodenso. Os centros fibrilares, na realidade, correspondem às NOR nas células em intérfase (Figura 9.4b).
Figura 9.1 Um ou mais nucléolos por núcleo em células animais (a) e vegetais (b). a. Células humanas MCF-10A coradas com azul de toluidina e tratadas com MgCl2 b. Células meristemáticas de Allium sativum impregnadas por prata. Figura 9.2 Hepatócito de camundongo observado ao microscópio eletrônico, salientando nucléolo (nu) circundado
por áreas heterocromáticas (h). Cortesia de Benedicto de Campos Vidal.
Figura 9.3 Núcleos de células de Triatoma infestans onde o nucléolo (nu) aparece circundando a área heterocromática (h). a. Preparado corado com fast green a pH 2,7 e observado ao microscópio de luz. b, c. Material submetido (b) ou não (c) ao método de Bernhard, preferencial para RNP, observado ao microscópio eletrônico. Reproduzidas do artigo de Mello et al. (Revta Brasil Genét 1990; 13: 5), com permissão.
Figura 9.5 a-c. RNA nucleolar exibindo metacromasia enquanto o DNA da cromatina aparece corado em verde (método de CEC para DNA). d-f. Proteínas não histônicas reveladas por fast green a pH 2,7 após tratamento salino (d), resposta AgNOR positiva (e) e eosina (f). g-h. Corpo semelhante a nucléolo, metacromático, junto à placa metafásica (g, seta) e RNA nucleolar deslocado para a região do fuso mitótico entre os dois blocos de cromossomos em movimento no fim de anáfase (h) (cromossomos em verde, método de CEC para DNA). a, d, f-h. Células epiteliais mamárias humanas. b,c. Células meristemáticas de Allium cepa. Reproduzidas do artigo de Mello et al. (Acta Histochem Cytochem 1993; 26: 1), com permissão; g,h reproduzidas do artigo de Mello (Acta Histochem Cytochem 1995; 28: 149), com permissão
Do nucléolo podem ser isolados RNA (até 10%), proteínas não-histônicas (até 85%) e DNA ribossomal (DNAr) (até 17%). Conteúdos elevados de DNA são devidos, geralmente, à contaminação por alguma região cromatínica adjacente às regiões organizadoras do nucléolo.
Se for excluído o DNA da composição química do nucléolo, a proporção RNA: proteína irá variar de 1:30 a 1:5, sendo mais comum a razão 1:11,5. A participação de RNA na composição do nucléolo pode ser demonstrada bioquimicamente ou por radioautografia (incorporação de uridina tritiada observada in situ) ou, ainda, por métodos citoquímicos.
Os métodos bioquímicos permitiram que fossem relatadas diversas espécies de moléculas de RNAr identificadas em unidades S (=svedberg), que medem a velocidade de sedimentação de partículas. Tais unidades são influenciadas pelo tamanho, forma e densidade dessas partículas, bem como pelo meio no qual as mesmas se encontram suspensas (1S corresponde a um coeficiente de sedimentação de 10 -13 segundos). O nucléolo também apresenta pequenas ribonucleoproteínas chamadas snoRNP (small nucleolar RNP), contendo muitos diferentes snoRNA, que participam em diversas etapas da construção dos ribossomos, sendo muito importante o snoRNA U3, que se complexa à fibrilarina. (Tabela 9.1). Os snoRNA guiam as enzimas de modificação a sítios específicos do RNAr. Outros snoRNA promovem a clivagem do precursor do RNAr em RNAr maturos, alterando a conformação da molécula desse precursor.
Essas partículas permanecem no nucléolo quando as subunidades ribossomais são exportadas para o citoplasma.
A proteína fibrilarina é encontrada não apenas no nucléolo, mas em outras pequenas estruturas nucleares conhecidas como corpos de Cajal, cujo número por núcleo é variável. Nos corpos de Cajal os snRNA, pequenos RNA nucleares envolvidos em splicing do pré-RNAm, bem como os snoRNA, sofrem suas modificações finais, com agregação de proteína, sendo também aí o sítio de sua reciclagem.
Figura 9.4 Diferentes tipos de nucléolo visualizados ao microscópio eletrônico. a. Reticulado, onde o nucleolonema aparece indicado com uma seta. Célula epitelial de Triatoma infestans. b. Compacto (nu) onde são indicados os centros fibrilares (FC). A morfologia deste nucléolo é típica de atividade reduzida. Célula de raiz de Allium cepa. Cortesia de Maria del Carmen Risueño & Maria Encarnación Fernández-Gómez. c. Com camadas concêntricas, onde a camada central filamentosa (F) é distinta da camada cortical granulosa (G). 0ócito de anfíbio. Cortesia de OL Miller Jr.
Tabela 9.1 Principais proteínas nucleolares descritas
A presença de RNA no nucléolo pode ser demonstrada por métodos citoquímicos de basofilia em que se usa:
1) azul de toluidina a pH 4,0 como corante, tendo-se como controle preparados previamente digeridos com RNase; ou 2) tratando-se os preparados, já corados com azul de toluidina, com uma solução de MgCl2 de baixa molaridade.
No primeiro caso, após coloração, não precedida por tratamento enzimático, os nucléolos aparecerão fortemente corados em violeta (metacromasia), dado o seu conteúdo em RNA, cujos grupos fosfato têm alta afinidade pelas moléculas desse corante catiônico. Com o tratamento enzimático, sendo removido o RNA, apenas o DNA aparecerá corado com azul de toluidina no núcleo. No segundo método, as moléculas de azul de toluidina irão competir com as de Mg2+ pelos mesmos sítios aniônicos no substrato, no caso grupos fosfato de DNA e RNA. O DNA ligará poucas moléculas de corante e aparecerá corado em verde, porque sua concentração crítica de eletrólitos (CEC) terá sido alcançada, enquanto o RNA (especialmente ribossomal) aparecerá corado em violeta (metacromasia) (Figuras 9.5a-c), porque a sua CEC é superior à do DNA, somente sendo atingida em concentrações de Mg2+ muito mais elevadas.
Em microscopia eletrônica, há um procedimento citoquímico conhecido como método de Bernhard, que é preferencial para complexos de RNA-proteína, fazendo com que esses componentes apareçam mais eletrodensos, enquanto áreas cobertas por DNA aparecem eletrolúcidas. Serve, portanto, como indicador da localização do nucléolo e para estudos de seus elementos granulares. (Figura 9.3b). A análise bioquímica esclareceu que a maioria das proteínas nucleolares tem um ponto isoelétrico neutro ou levemente ácido ou ainda básico. Seu número chega a mais de 3 centenas, o que foi estabelecido por uma série de novas metodologias proteômicas. Há proteínas nucleolares que participam da transcrição do DNAr, do processamento do RNAr e da maturação, organização e transporte das partículas pré-ribossomais (Tabela 9.1).Parte das proteínas encontradas no nucléolo são enzimas, não permanentemente presentes na organela (Tabela 9.1). A presença de proteínas não-histônicas no nucléolo pode ser revelada por métodos citoquímicos, como, por exemplo, coloração para proteínas totais com fast green após remoção de histonas (Figuras 9.3a e 9.5d), ou com eosina (Figura 9.5e), ou ainda com métodos de impregnação por prata (Figura 9.5f). A prata se liga a proteínas associadas ao RNAr transcrito nos sítios de DNAr, tanto naqueles transcricionalmente ativos como naqueles que já transcreveram, como é o caso dos cromossomos metafásicos. B23 e C23 são as principais proteínas nucleolares a se impregnar pela prata2,3,8 (Tabela 9.1). Algumas das enzimas, como as ATPases, podem ser detectadas por procedimentos citoquímicos para microscopia de luz e para microscopia eletrônica (Figura 9.6). A imunocitoquímica também permite que se determinem os locais em que diferentes tipos de RNA ou de proteínas nucleolares se acham localizados.
Quanto ao DNAr, a análise bioquímica permite demonstrar que suas unidades são repetitivas, podendo atingir 1.700 cistrons, como acontece em núcleos diplóides de milho. Além disso, geralmente o DNAr possui um alto teor em bases nitrogenadas GC (ao redor de 60%).
Figura 9.6 Atividade ATPásica detectável por método de precipitação com nitrato de chumbo em nucléolo (nu) de célula epitelial de Triatoma infestans. (Maria Tercilia V. Azeredo-Oliveira & Maria Luiza S. Mello)
Organização molecular e papel fisiológico na biogênese de ribossomos
O nucléolo se encontra envolvido na biogênese de ribossomos, não unicamente com respeito à síntese dos RNAr mais pesados, mas também quanto ao seu processamento pós-transcricional e sua reunião, seja com RNAr mais leves, seja com proteínas.
Ocorrem muitas modificações químicas no precursor de RNAr antes que esse RNA venha a se tornar parte integrante do ribossomo. Essas modificações provavelmente auxiliem na dobradura e na agregação dos RNAr finais e alterem a função dos ribossomos.
Não é recente o conhecimento de que o nucléolo participa na produção de ribossomos. Há muito tempo já se havia observado que células com alta atividade em síntese de proteína possuíam nucléolos particularmente proeminentes. Porém, uma evidência mais crucial nesse sentido surgiu quando se descobriu que em embriões anucleolados do anfíbio Xenopus, obtidos por um defeito cromossômico hereditário, não havia produção de ribossomos. Tais embriões anucleolados se desenvolviam até um pouco além da eclosão, fazendo uso de ribossomos preexistentes trazidos pelo óvulo, e então, quando se tornava necessária a produção de mais ribossomos, vinham a morrer. Com isso, estabeleceu-se uma correlação entre produção de ribossomos e presença de nucléolo. Mais tarde, veio a se comprovar no próprio Xenopus que os RNAr mais pesados, extraídos e purificados de animais normais, não se hibridizavam com o DNA dos embriões mutantes, pois faltavam no DNAr dos mutantes as seqüências de bases requeridas para a formação dos RNAr 18S e 28S. Em termos simplificados, a técnica consiste em se incubar RNAr 18S ou 28S ou ambos, marcados radioativamente, com preparados de cromossomos cujo DNA é previamente desnaturado, sendo, então, detectada radioatividade nos sítios de DNA em que as seqüências complementares se associam.
Genes 5S
Tabela 9.2 Número de genes para RNAr
Figura 9.7 Organização da unidade de transcrição nucleolar
A descoberta dos genes codificadores para RNAr 18S e 28S, na região organizadora nucleolar, trouxe um grande avanço para a compreensão da fisiologia nucleolar. Na realidade, a NOR contém um "motivo" genético altamente redundante, variando conforme o organismo (Tabela 9.2).
Deste "motivo" genético, apenas uma parte é a unidade de transcrição, sendo o restante um segmento que, em geral, não é transcrito, conhecido como espaçador (spacer) (Figura 9.7). A seqüência espaçadora não transcrita geralmente varia em comprimento entre e dentro das espécies (Tabela 9•3).
A unidade de transcrição dá origem ao transcrito primário, ou seja, ao RNA pré-ribossomal 40S (anfíbios) ou 45S (mamíferos), que contém as seqüências de três genes referentes aos tipos de RNAr: 18S, 5,8S e 28S e mais DNAr. dois segmentos intercalares transcritos (ITS), um que separa o RNAr 18S do RNAr 5,8S (ITS 1), e outro, que separa o RNAr 5,8S do RNAr 28S (ITS 2) (Figura 9.7). O transcrito primário contém ainda uma seqüência externa transcrita (ETS), que antecede a seqüência correspondente ao RNAr 18S (Figura 9.9). O transcrito primário é clivado, sendo eliminada a seqüência ETS e, a seguir, as correspondentes aos segmentos intercalares ITS. A unidade de transcrição é, portanto, mais longa do que o comprimento dos RNAr transcritos somados (Tabela 9.3). Durante o processo de maturação dos transcritos, o RNAr 5,8S se associa ao RNAr 28S por ligações de hidrogênio. Em Drosophila, ocorre também outro RNAr leve, 2S, que, como o RNA 5,8S, associa-se por ligações de hidrogênio ao RNAr 28S. Ainda em Drosophia, certos genes para o RNA 28S contêm um intron (por íntron define-se cada região intercalar do gene, cujo produto ribonucléico transcrito estará ausente do RNA maturo definitivo codificado por esse gene) e três DNA satélites acham-se também presentes entre os genes 18S e 28S. No protozoário Tetrahymena, foi demonstrado que o gene para o RNAr correspondente ao 28S (no caso, RNAr 26S) contém um íntron com 413 pares de bases, tendo sido demonstrado que a seqüência do RNA transcrito, correspondente a esse íntron, é auto-excisada sem o concurso de enzimas para tal processo.
Unidade de transcrição (pb)
RNAr (% do transcrito)
Espaçador não-transcrito (pb)
3.750 - 6.450
2.300 - 5.300
Tabela 9.3 Tamanho de seqüências de DNAr
Figura 9.8 Etapas pós-transcricionais do RNAr 45S
Por outro lado, o RNAr 5S, que junto com o 28S irá fazer parte da subunidade ribossômica maior, não é transcrito na região organizadora do nucléolo e sim em outras regiões cromossômicas, pela RNA polimerase III, sendo reunido ao RNAr 28S no nucléolo. É interessante acrescentar que os genes que codificam o RNAr 5S se acham presentes no mutante anucleolado de Xenopus, mencionado no início deste capítulo.
O número de genes para RNAr 5S, nos eucariotos superiores, excede o dos genes dos RNAr mais pesados (Tabela 9.2). Em bactérias, onde há produção de RNAr, embora não exista nucléolo, o gene para RNA 5S faz parte da mesma unidade que a dos outros RNAr (16S/23S), sendo eles todos transcritos simultaneamente. No entanto, os genes múltiplos para RNAr são espalhados pelo genoma e não múltiplas seqüências em "tandem", como acontece com as seqüências dos genes 18S/28S nos eucariotos. São diversas as etapas do processamento do RNA ribossomal. A partir da transcrição das grandes moléculas precursoras de RNAr (RNA 45S), ocorre metilação nas riboses desse RNA e clivagem em pontos correspondentes a porções não-metiladas, originando-se, assim, uma molécula 32S e outra 18S (Figura 9.8). As metilações, portanto, protegem sítios importantes da molécula de RNA, impedindo sua clivagem em locais que acarretariam destruição de seqüências específicas. A molécula de RNA 18S transfere-se rapidamente do nucléolo para a subunidade ribossômica menor, migrando então para o citoplasma. As seqüências dos segmentos espaçadores transcritos são rapidamente destruídas durante as reações de processamento. A molécula 32S se clivará, com perda de RNA não-metilado, formando a molécula de RNA 28S, associada por ligações de hidrogênio à do RNA 5,8S (Figura 9.8). Essas duas passam um curto espaço de tempo no nucléolo antes de transferir-se para a subunidade ribossômica maior, que migra para o citoplasma. A associação de RNA com proteínas inicia-se antes do precursor 45S ter sido totalmente transcrito. As moléculas de RNA 45S, associadas a proteínas, constituem as fibrilas de RNP do nucléolo, com coeficiente de sedimentação 80S. À medida que o processo pós-transcricional continua, algumas proteínas das partículas precursoras vão sendo eliminadas, ao mesmo tempo em que outras vão sendo adicionadas. Possivelmente algumas delas sirvam para proteger certos sítios de clivagem por nucleases, enquanto outras, inversamente, tornem outros sítios acessíveis ao ataque por essas enzimas. No final do processo, serão obtidas as subunidades ribossomais 40S e 60S, tratando-se de eucariotos. É importante salientar que, desde a descoberta de moléculas de RNA com atividade catalítica, sugeriu-se que o RNAr pudesse ter um papel mais ativo na própria função ribossomal. Há evidências de que o RNAr interaja com RNAm ou RNAt em cada fase da tradução e que justamente as proteínas associadas ao RNAr sejam necessárias para mantê-lo numa estrutura tal a permitir que ele execute funções catalíticas.
Expressão morfológica da transcrição e de eventos pós-transcricionais de RNAr Nos nucléolos de anfíbios, tanto a região fibrilar interna ou central, como a granulosa cortical, contêm RNAr e proteínas. O DNA se encontra na região fibrilar, que é ausente de grânulos. A síntese do precursor pesado maior (transcrito primário) do RNAr é detectada no componente fibrilar. A seguir, partículas de RNP, com cerca de 150 a 400 Å de diâmetro, aparecem na região granulosa do nucléolo. Essa observação foi constatada por radioautografia e dados morfológicos em nível ultraestrutural por Miller e Beatty, em 1969. É importante salientar que nos oócitos de anfíbios o DNA ribossomal (DNAr) do motivo genético repetitivo se torna extracromossômico, ou seja, se desprende do cromossomo ao qual originalmente pertencia. Esse DNA passa por várias replicações não-acompanhadas pela replicação do genoma restante, o que é denominado de amplificação gênica. Admite-se que as primeiras cópias do DNAr aconteçam enquanto esse DNA ainda faz parte do cromossomo e então se destaquem da região do organizador nucleolar e se tornem repetidamente amplificadas. Submetendo-se o nucléolo de anfíbios a choque osmótico, como o fizeram Miller e Beatty, as duas regiões nucleolares se destacam. Ao microscópio eletrônico, vê-se que o emaranhado filamentoso da região central se distende, mostrando ser constituído por um fino eixo com 100 a 300 Å de diâmetro, coberto a intervalos periódicos por uma matriz fibrilar (Figura 9.9, M). Cada segmento recoberto por matriz apresenta cerca de 100 fibrilas, que se distribuem de acordo com seu comprimento, com polaridade, de curtas a longas, e se ligam por uma de suas extremidades ao filamento axial, apresentando o conjunto um aspecto que lembra uma "árvore ou pinheiro de Natal". A polaridade na distribuição das fibrilas é a mesma para todas as unidades num mesmo nucléolo. As unidades com matriz são separadas das unidades vizinhas por segmentos axiais livres de matriz, os espaçadores (Figura 9.9,S). O eixo filamentoso, contendo o total de segmentos M+S, é um círculo que pode atingir 35 µm a 5 mm. Figura 9.9 A região central de um nucléolo de oócito de Triturus viridescens distendida após choque osmótico, observada ao microscópio eletrônico (a) e em esquema (b). Em M (matriz) são indicadas fibrilas de RNAr-proteína (RNP) que recobrem em intervalos constantes um eixo de DNA-proteína (DNP); parte desse eixo é livre de M, sendo denominado S (espaçador) (cortesia de DL Miller Jr & BR Beatty)
Digestão com DNase remove o eixo longo central das unidades com matriz, bem como os segmentos livres de matriz, enquanto tratamento com RNase ou protease remove as fibrilas da matriz. Proteases também reduzem o diâmetro do eixo central. Dados de radioautografia, em microscopia eletrônica, indicam que os segmentos livres de matriz não incorporam ribonucleosídeos tritiados, ao contrário do que acontece nas unidades com matriz. A incorporação nesses sítios corresponde, em tempo, à síntese de moléculas precursoras de RNAr. O conjunto de achados nesse campo indica que as fibrilas da matriz são compostas de RNAr 40S, recém-sintetizado e em elongação, associado a proteínas, enquanto o eixo longo filamentoso é composto de DNA-proteína. Os segmentos axiais sem matriz ou espaçadores (S), predominantemente ricos em GC ou em AT, geralmente não transcrevem. Admite-se que tenham a função de aumentar a freqüência de iniciação da transcrição, induzindo diversas moléculas de RNA polimerase I a se ligar sucessivamente à seqüência gênica promotora para a síntese de RNAr 40S. Na intersecção de cada fibrila da matriz com o eixo de DNA-proteína, observa-se uma estrutura granular com 125 À de diâmetro, admitida como sendo uma molécula de RNA polimerase.
Nos segmentos sem matriz, também são vistos tais grânulos, o que poderia significar que cada polimerase continua se movendo sobre o DNA, após ler o gene ribossomal. Considerando-se que cada fibrila da matriz representa uma molécula de RNAr 40S em maturação, sendo transcrita por uma polimerase, ao menos 100 moléculas de RNA polimerase estarão presentes em cada cístron de DNAr nos nucléolos de oócitos de anfíbios. Com tantas polimerases em ação ao mesmo tempo, é de se esperar que ocasionalmente surjam "erros", o que de fato acontece, como moléculas de 40S mais longas e polaridade oposta de fibrilas e seqüências M não intercaladas com a seqüência S. A análise de micrografias eletrônicas de Miller e Beatty revela que cada unidade com matriz, nos oócitos de anfíbios, mede entre 4,3 a 5 µm (estado estirado) ou 2,5 µm (estado não-estirado) de comprimento e o segmento livre de matriz, 2,7 a 3 µm (quando o eixo está o mais estirado possível). Estimativas da massa molecular da molécula precursora de RNAr em anfíbios (-2,55 x106) indicam que o gene que codifica para o precursor tem aproximadamente 3µm de comprimento, considerando-se que seja uma molécula de DNA em configuração B (1 mm de DNA nessa configuração codifica 1 x 106 dáltons de RNA monocatenário, com um comprimento de 2 µm). O RNA transcrito, com 2,6 x 10µ dáltons, teria um comprimento aproximado de 5 µm, ao longo de sua cadeia polinucleotídica.
As fibrilas de RNA-proteína nas extremidades finais dos genes têm 0,5 µm de comprimento, indicando que a molécula precursora de RNAr está enovelada, por associação com proteína, fornecendo uma razão 10:1 de RNA:comprimento de fibrila de RNP. Na região granulosa dos nucléolos de anfíbios são encontradas fibrilas de RNP que, ao se enovelar, adquirem a forma de grânulos. O RNAr 32S localiza-se nessa região do nucléolo. Embora não seja sintetizado na região organizadora nucleolar, nas partículas granulosas, está também presente o RNAr 5S, contendo ao redor de 120 nucleotídeos. Esse RNAr é encontrado numa relação de 1:1 com o RNAr 28S, em ribossomos de células de mamíferos. Possui uma forma de folha de trevo, semelhante à do RNAt 4S, e supõe-se que sua presença seja requerida para que o ribossomo seja funcional. A mesma expressão morfológica da transcrição de RNAr como a descrita para anfíbios, com pequenas variações, e mesmo para alguns outros tipos de RNA, encontra-se nos outros organismos eucariotos, mostrando que esse sistema de transcrição tem um caráter universal e que os achados reportados por Miller e Beatty foram muito importantes para essa elucidação.
A análise proteômica dos nucléolos humanos revelou um total de ~350 diferentes proteínas nucleolares, poucas das quais com função conhecida (Tabela 9.1) e algumas com funções hipotéticas depreendidas por meio de análise por bioinformática.
31 proteínas nucleolares participam da biogênese dos ribossomos, porém foram identificadas também no nucléolo proteínas do sistema proteíno-cinase dependente de DNA, um complexo multifuncional envolvido em muitos processos biológicos, como o reparo do DNA e a manutenção do telômero. Outras 25 proteínas acham-se ainda envolvidas na regulação do metabolismo do RNAm. Esses achados dão uma idéia da natureza plurifuncional do nucléolo e indicam que muitas novas descobertas estão por vir, trazendo informações sobre inesperadas atuações do nucléolo.
Nucléolo e citodiagnóstico
A análise de parâmetros geométricos que informam tamanhos, número e formas dos nucléolos é uma ferramenta importante utilizada por citologistas e citopatologistas para a avaliação da atividade funcional de células humanas. Nas células epiteliais mamárias humanas em cultura expressando diferentes estágios da progressão tumorigênica induzida experimentalmente pelo benzo[a]pireno, elemento carcinógeno do fumo, o tamanho nucleolar, bem como a razão área nucleolar/área nuclear, mostraram-se correlacionados à expressão do fenótipo tumorigênico. Assim, puderam ser considerados como elementos importantes no citodiagnóstico, em particular para o modelo estudado. Também a avaliação do número e/ou área ocupada nos nucléolos pelos locais de acúmulo de proteínas das regiões organizadoras do nucléolo (NOR) sensíveis impregnação por prata (Ag) (resposta AgNOR positiva) são consideradas por muitos profissionais da área de saúde no diagnóstico de situações patológicas. Muitas vezes as informações levantadas quanto aos dados de AgNOR permitem a avaliação da funcionalidade nucleolar e da rapidez da proliferação celular em alguns tipos de lesões, inclusive tumorais. Se os dados de AgNOR forem associados à avaliação do tamanho nucleolar, as conclusões se revestirão de maior confiabilidade. No entanto, é preciso cautela quanto a generalizações, pois nem todos os tipos de lesões tumorais podem ser diagnosticados meramente pelo estabelecimento de valores AgNOR37 e alterações em valores AgNOR podem estar refletindo apenas uma atividade funcional exacerbada não-patológica.
O nucléolo durante a mitose
Segundo descrições clássicas, o nucléolo desaparece no fim da prófase e reaparece na telófase, junto aos sítios NOR. A reformulação pós-mitótica dos nucléolos dependeria da interação de duas entidades separadas, as regiões NOR e os corpos pré-nucleolares, que aparecem na telófase.
Mais recentemente, constatou-se que os componentes nucleolares, RNAr e proteínas não se dissolvem no citoplasma, durante a divisão celular. O RNA permanece como um envoltório ao redor dos cromossomos na placa metafásica, porém, quando da migração destes para os pólos, desloca-se para a região junto aos microtúbulos do fuso entre os dois blocos cromossômicos em movimento, assim permanecendo até a telófase (Figura 9.5h). Parte das proteínas nucleolares, na metáfase, também se posiciona em volta dos cromossomos, porém permanece acompanhando os respectivos blocos cromossômicos, em sua migração para os pólos.
Supõe-se que esses componentes, ou parte deles, participem da reorganização dos nucléolos na telófase.
Admite-se também, ao menos com relação aos componentes que permanecem em intima associação aos cromossomos, que formem uma estrutura organizada tal que desempenhe um papel protetor do material genético, numa situação em que a lâmina nuclear se encontra dissociada e espalhada pelo citoplasma, além de se constituir em sitio de armazenamento de fatores de maturação de RNAr.
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