Determination of pirimicarb diagnostic concentration in order to detect oopulations of Myzus persicae (Sulz.) (Homoptera: Aphididae) with different esterase levels
http://dx.doi.org/10.1590/S0301-80592000000400013
Determinação da concentração diagnóstica de pirimicarbe para a detecção de populações de Myzus persicae (Sulz.) (Homoptera: Aphididae) com diferentes níveis de esterases
IIDepartamento de Zoologia, Universidade Federal do Paraná, Caixa postal 19020, 81531-990, Curitiba, PR; e-mail: lazzari@bio.ufpr.br
Palavras-chave: Insecta, pulgão-verde-de-patata, resistência a inseticidas, ensaios colorimétricos, esterases totais, bioensaios com inseticidas, pirimicarbe
Key words: Insecta, green peach aphid, insecticide resistance, insecticide bioassays, colorimetric assays, pirimicarb, diagnostic concentration
O monitoramento de insetos resistentes a inseticidas tem sido feito, tradicionalmente, através de comparações de DL50, DL90, ou da inclinação das retas de respostas a doses de inseticidas, entre populações de campo e populações suscetíveis de referência em laboratório. Embora adequados para a detecção da resistência em altas freqüências, estes métodos são insensíveis a pequenas mudanças na freqüência da resistência. Testes diagnósticos são mais eficientes para detectar freqüências mais baixas (em torno de 10%) de resistência, porque todos os indivíduos são testados em dose apropriada. Alem disso, menos insetos são requeridos para os ensaios pois não se aplicam doses ou concentrações menores, nas quais a porcentagem de mortalidade não é informativa (ffrench-Constant & Roush 1990, Roush & Miller 1986).
O termo dose discriminante é usado quando se sabe que a dose causa diferentes respostas entre o genótipo da espécie estudada; já o termo dose diagnóstica é menos rigoroso e é utilizado quando se quer monitorar a resistência, sendo, porém menos preciso que o primeiro (Halliday & Burnham 1990).
A determinação da dose ou concentração diagnóstica tem sido usada para o monitoramento da resistência em Myzus persicae (Silz.) pois é rápida, fácil de ser utilizada, inclusive por técnicos de campo, e não querer procedimentos sofisticados.
Sawicki et al. (1978) determinaram que 0,025% de pirimicarbe e 0,02% de demeton-S-metil são capazes de matar os indivíduos suscetíveis(S) e levemente resistentes (R1) de populações britânicas de M. persicae, porém, permitem a sobrevivência de indivíduos altamente resistentes (R2). Os R1 sobrevivem apenas ao demetron-S-metil e os S morrem com a aplicação de qualquer um dos dois inseticidas. Os autores concluíram que essas concentrações discriminantes não medem a abundancia relativa dos indivíduos resistentes ou sucessíveis dentro da população porque as respostas às concentrações para S e R1 se sobrepõem, servindo simplesmente para a detecção dos últimos. Estes autores complementaram satisfatoriamente seus estudos com a análise de esterases através de técnicas de eletroforese. Concluíram que a aplicação de 0,025% de pirimicarbe resulta em 100% de mortalidade dos variantes S, 93-100% dos R1 e 38-69% dos R2, podendo ser utilizada para a discriminação deste ultimo variante.
Este trabalho foi realizado com objetivo de determinar a concentração diagnostica de primicarbe para a avaliação dos níveis de resistência em populações de Myzus persicae, contribuindo para o estabelecimento de programas de manejo da resistência do afídeo na cultura da batata.
Foram coletadas amostras de 14 populações de M. persicae em cultivos comercias de batata: uma população em Curitiba (PR); uma em Piraí do Sul (PR), cinco em Contenda (PR) e sete em Ibicoara (BA), no período de 1994 a 1996. A colheitas foram feitas ao acaso, percorrendo-se a área em diagonal, e amostrando-se 400 plantas, distantes umas das outras pelo menos 2 m, para evitar populações clonais. Os afídeos foram coletados juntamente com os folíolos de cada planta sorteada, colocados em sacos plástico com papel absorvente para evitar o excesso de umidade, os quais foram etiquetados e levados ao laboratório para a realização dos testes.
Bioensaios. Os bioensaios foram realizados no mesmo dia das coletas, sendo a CL50 estimada. Forram feitas quatro repetições com o pirimicarbe em diversas concentrações e uma testemunha com água esterilizada.
A metodologia utilizada foi modificada de Sawicki et al. (1978). Para cada repetição foram colocadas 10 fêmeas vivíparas ápteras num cilindro de plástico transparente (2,5 cm de altura e 2,5 cm de diâmetro) com o fundo coberto por uma tela de malha fina. O conjunto foi colocado sobre uma placa de Petri de vidro. Sobre os afídeos foram pipetados 2 ml de uma solução de pirimicarbe (Pi-RIMOR® 50PM, inseticida carbamato) nas concentrações de 0,0031; 0,0062; 0,0125; 0,025; 0,05 e 0,1% em água (g/100 ml). Após o contato com a suspensão por 10 segundos os afídeos foram secos, colocando-se o fundo do cilindro sobre um papel filtro. Na parte superior do frasco foi colocada uma tampa com tela de malha fina, e o frasco foi invertido para q os afídeos caíssem para a tela limpa. Os frascos com os insetos foram colocados em câmeras com temperatura aproximada de 25ºC e, após 1h, foram examinadas sob microscópio esteroscópico, anotando-se o numero de indivíduos mortos. O afídeo foi considerado morto, quando sob a ação de um leve toque de um pincel fino (FAO 1979), não consegui levantar-se após ter caído de costas.
Os resultados foram submetidos a analise de Probit, através do programa POLO-PC (LeOra Software 1987), para estimar a CL50. Foi aplicada análise de variância aos dados de porcentagem de mortalidade, trans-formados segundo arco seno da raiz de x/100, nas concentrações de 0,025 e 0,05% de primicarbe. A razão de resistência (RR) foi calculada pela divisão entre a CL50 da população resistente a CL50 da população Contenda 1, considerada suscetível devido à alta mortalidade e ao histórico de baixa pressão seletiva a campo.
Aproximadamente 200 afídeos, incluindo indivíduos mortos e vivos nos bioensaios, foram congelados 1h após o tratamento, a - 15ºC para a análise de esterases.
Avaliação da Atividade Total das Esterases. Para esta avaliação segui-se a metodologia proposta por Devonshire et al. (1992). Os afídeos congelados, todos com aproximadamente o mesmo tamanho, foram tranferido com um pincel fino para uma microplaca com 96 vasos de 150 µ de capacidade volumétrica cada. Os vasos continham 50 µl de uma solução tampão de fosfato de sódio (0,02 M, pH 7,0) com 0,1% de triton X-100 (tampão A). A placa era colocada sobre uma camada de gelo, e os afídeos macerados individualmente com um bastão de vidro. Foram aplicados 25 µl de de cada amostra em cada poço de uma placa, os quais já continham 25 µl do tampão A. Em seguida adiciona-se 150 µl de a-naftil acetato (30 mM), em cada poço da microplaca, a qual foi deixada incubar por 5 min. a coloração foi feita com 25 ml de "fast blue B salt" (0,3% dissolvido em 15 ml de água e 35 ml de SDS 5%), adicionando em cada poço; a placa foi colocada no escuro por exatamente 20 min a 25ºC. A leitura foi feita em leitor de microplaca (MR 600-Dynatech Product), com comprimento de onda de 630 nm. Os quatro primeiros vasos de microplaca receberam apenas os regentes e foram utilizados como padrão branco para o leitor eletrônico.
Os resultados do teste colorimétrico para os indivíduos mortos ou vivos nas concentrações 0,0125; 0,025; 0,05 e 0,1% de pirimicarbe foram agrupadas em diversas categorias, de acordo com os valores da absorbância, isso possibilitou a determinação da freqüência de indivíduos suscetíveis e resistentes da amostra (FA) e a freqüência de indivíduos vivos após o tratamento com primicarbe (FAT). Assim os indivíduos foram classificados (de acordo com os limites de absorbância indicados em nanômetros e modificado de Devonshire et al. 1992) em suscetíveis (S; 0-0,3 nm); suscetíveis ou levemente resistentes (S/R1; 0,31-0,4 nm); levemente resistentes (R1; 0,41-0,5 nm); levemente ou altamente resistentes (R1/R2, 0,51-0,8 nm); altamente resistentes (R2; 0,81- 1,5 nm); e extremamente resistente (R3; >1,51 nm).
As concentrações 0,0125% e 0,1% não foram analisadas com maior profundidade devido à baixa mortalidade de indivíduos suscetíveis (S) obtida na primeira concentração, e pela altíssima mortalidade de todos os resistentes e suscetíveis na segunda.
Na análise estatística realizada para comparar a mortalidade provocada por pirimicarbe entre as populações estudadas, consideraram-se apenas os resultados de CL50 com intervalo de confiança igual ou superior a 95%. Por essa razão as populações Ibicoara 7 e Contenda foram desconsideradas (Tabela 1).
Os resultados obtidos em 12 populações demonstraram que há diferença altamente significativa entre a mortalidade provocada pelas concentrações de 0,025 e 0,05% (F=51, 12; g.l.=1; P<0.00001). Contudo, para cada uma destas concentrações, não se obteve diferença significativa na mortalidade entre as populações das quatro regiões, isto é, não há interação entre as populações e as concentrações, pois, o comportamento de uma população assemelha-se ao de outra com relação à mortalidade (Tabela 1).
Devido a problemas no descongelamento das amostras apenas oito populações, das 14 estudadas, passaram pelo teste colorimétrico, cujos resultados estão contidos na Tabela 2.
A análise da mortalidade de indivíduos resistentes e suscetíveis na concentração 0,05% mostrou q esta é significativamente mais eficaz contra M. persicae do que as demais, ocasionando alta mortalidade, tanto em populações com freqüência elevada de indivíduos S (Ibicoara 1, 3 e 4), como em populações com baixa freqüência destes (Ibiocara 2 e 5 e Contenda 5) (Tabela 2). Esse resultado é explicado pela mortalidade comparativamente alta de indivíduos resistentes, tanto na concentração 0,05% como 0,025%, provavelmente devido ao estresse ocasionado pela viagem entre o campo e o laboratório. Desta forma as duas concentrações indicam somente a presença de indivíduos resistentes na amostra, não estimando a freqüência dos mesmos.
Na população Contenda 1, a mais suscetível encontrada nesta pesquisa, a mortalidade provocada pela concentração 0,05% foi de 86,7% contrastada com 48,6% da Ibicoara 6, a mais resistente. Com 0,025%, amortalidade foi 72,4 contra 17,3%, para as duas populações, respectivamente. Apesar de as duas concentrações discriminarem signiotivamente as populações estudadas (F=6,56; g.l.=10; P<0,00001), a concentração mais elevada permite diagnosticar com maior precisão a presença de indivíduos resistentes na amostra, eliminando 89,7% dos S como demonstrado na Fig. 1. A mortalidade dos indivíduos resistentes e suscetíveis de M. persicae, apresentados na Fig.1, foi obtida pela soma dos indivíduos mortos nas concentrações 0,0125; 0,025 e 0,05%. Os valores da absorbância permitiram caracterizar os indivíduos de acordo com o niveis de atividade das esterases totais, os quais foram agrupadas em suscetíveis (S) e resistentes (R), incluindo na ultima categoria: R1 (levemente resistentes); R2 (altamente resistentes) R3 (extremamente resistentes) e as categorias intermediarias S/R1 (S ou levemente resistente) e R1/R2 (R1 ou altamente resistente), as quias não poderam ser caracterizadas com precisão devido à sobreposição dos valores da absorbância.
Os resultados obtidos com a concentração 0,025% de pirimicarbe nesta pesquisa, onde a mortalidade chegou a 73,8% em S; 68,0% em R1 (levemente resistentes) e 25,39% em R2 (altamente resistentes), contrastam com o relatado por Sawicki et al (1978), que observaram mortalidade de 100; 93-100 e 38-69%, respectivamente, em populações britânicas de M. percicae. A concentração 0,05% de pirimicarbe resultou na mortalidade que mais se aproxima dos resultados encontrados por esses autores, com 89, 7; 72,0 e 53,7%, respectivamente (Fig.1). Portanto, a utilização da concentração 0,025% nas populações estudadas não descriminaria os R2, como preconizados pelos autores citados, uma vez que a sobrevivência de S e R1 seria muito elevada.
Assim, a concentração de 0,05% de pirimicarbe pode ser utilizada para diagnosticar populações resistentes de M. persicae nas regiões estudadas, considerando que não diferença significativa na mortalidade de afídeos entre regiões. Essa concentração permite a sobrevivência de aproximadamente 50% do R2, variante importante na estimativa da CL50 em populações de campo deste afídeo.
A presença de indivíduos S vivos, 1 h após o mergulho na suspensão de pirimicarbes a 0,05%, pode significar que esses indivíduos são portadores de outro mecanismo de resistência diferente daquele baseado na alta produção das esterases E4/FE4, devido à amplificação gênica. Essas enzimas degradam e seqüestram inseticidas organofosforados, carbamatos e piretróides. Recentemente, Graham et al. (1994) registraram a ocorrência de acetilcolinesterase especialmente insensível ao pirimicarbe (AChE) em homozigotos e heterozigotos de M. persicae. Esse gene, em condições em condições de laboratório, aumentoua do inseto a pirimicarbe em 15 vezes. Outros mecanismos de resistência, como redução na peneiração de inseticidas no corpo do inseto e alvo de ação insensível podem estar envolvidos.
Devonshire, A.L., G.J. Devine & G.D. Moores. 1992. Comparation of microplate esterases assay and immunoassay for identifying insecticide resistant variants of Myzus persicae (Homoptera: Aphididae). Bull. Entomol. Res. 82: 459-463. [ Links ]
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Sawicki, R.M., A.L. Devonshire, A.D. Rice, G.D. Moores, S.M. Petzing & A. Cameron. 1978. The relation and distribution of organophosphorus and carbamate insecticide-resistant Myzus persicae (Slz.) in Britain in 1976. Pestic. Sci. 9: 189-201. [ Links ]